关键词：药敏检测 个体化治疗
（本文作者：广州医学院附属肿瘤医院 韩国栋等）
Ⅱ～Ⅲ期(U ICC1997肺癌分期标准)非小细胞肺癌( non－small－cell lung cancer,NSCLC)多采取以手术为主的综合治疗,但效果不理想,失败的主要原因为术后复发和远处转移。新辅助化疗又称诱导化疗或术前化疗,指恶性肿瘤在局部治疗(手术或放疗)之前给予的全身化疗,对提高手术切除率、延长术后生存期有一定作用。近年来体外肿瘤药敏试验指导个体化化疗受到重视,三磷酸腺苷生物荧光肿瘤化疗药敏检测(adeno－sine triphosphate biolummescence tumor chemosensitivity assay,ATP-TCA)因其具有灵敏、快速、与临床相关性较好的特点,已被广泛应用。本文采用该方法检测40例NSCLC患者标本,探讨应用该方法指导NSCLC个体化新辅助化疗的可行性。
1 资料与方法
1. 1 病例来源及分组 采用我院2005年1月至2007年12月在胸外科住院的部分Ⅱ、Ⅲ期非小细胞肺癌(NSCLC)患者79例,均经病理学确诊。按住院先后随机分组,试验组40例,其中男28例、女12例,中位年龄58岁,鳞癌18例、腺癌15例、腺鳞癌5例、其他3例, Ⅱb期6例、Ⅲa期28例、Ⅲb期6例。对照组39例,其中男29例、女10例,中位年龄57岁,鳞癌14例、腺癌18例、腺鳞癌5例、其他2例, Ⅱb期4例、Ⅲa期28例、Ⅲb期7例。两组一般资料比较差异无统计学意义( P > 0. 05) 。对照组经验性选择第三代含(顺)铂两药联合化疗方案,包括长春瑞滨+顺铂(NP) 、吉西他滨+顺铂(GP) 、紫杉醇+顺铂(TP)及多西他赛+顺铂(DP)行新辅助化疗。试验组在采取肿瘤标本行病理学检查的同时, 另取1 mm*3 以上肿瘤组织行ATP-TCA检测,取材方法包括纤维支气管镜活检22例、经皮肺穿刺活检13 例、淋巴结穿刺活检和开胸活检各2 例。根据ATP-TCA体外药敏检测结果,选择相应敏感的方案行新辅助化疗,不敏感者直接行手术、放疗或靶向治疗。
1. 2 试剂药物 ATP-TCA试剂盒,包括: 组织消化酶、ATP提取液、96孔培养板、荧光酶2荧光素系统、培养基、ATP生成抑制剂、红细胞裂解液、荧光酶工作液、ATP标准品,无菌圆底微孔细胞培养板等均为德国DCS公司产品,微板荧光分析仪为Berthord公司产品。化疗药物包括顺铂、长春瑞滨(均为江苏豪森药业股份有联合制药工业有限公司) 、吉西他滨、紫杉醇(海南中化联合药业公司)和多西他赛(江苏恒瑞医药股份有限公司) 。药物试验浓度参考各药常用临床剂量所对应的血浆峰值浓度:顺铂2. 5μg/ml,长春瑞滨1. 86μg/ml,吉西他滨25μg/ml,紫杉醇4. 9μg/ml和多西他赛4. 6μg/ml。
1. 3 实验方法 ATP-TCA操作方法:取新鲜肿瘤组织后立即浸入装有RPM11640培养液的无菌小瓶中,浸泡15 min,剪成0. 5～1 mm*3 碎块,转移于含组织消化液的离心管中,于37℃孵育箱中孵育1. 5～3 h,待其充分消化后过滤,得到单细胞悬液,400 g离心10 min,去上清,用培养基洗涤1次,若有明显红细胞沉淀则需要进行去除红细胞的操作,最后调整细胞浓度为( 2～4) ×105 个细胞/ml。取单细胞悬液,接种于96 孔培养板,每孔100μl,加入抗肿瘤药物,根据待测药物的临床使用剂量及其所对应的血浆峰值浓度( PPC) ,设定6 个检测浓度,即200%、100%、50%、25%、12. 5%、6. 25%的血浆峰值浓度,每个浓度作2个平行孔,同时设定无药对照孔和最大拟制孔(加入ATP抑制剂) 。将培养板置于37℃, 5% CO2 饱和湿度的细胞培养箱内培养5～7 d。按浓度顺序将ATP提取液加入96孔培养板,每孔50μl,室温静置5 min后振荡20～30 s,吸出50μl上清液,对应加入到荧光测定板中。每孔加入50μl ATP检测液,振荡10 s,立刻用荧光扫描仪测定各孔在560 nm波长处的荧光强度,计算出平均值。
1. 4 临床治疗结果判定
1. 4. 1 临床疗效:每周期化疗后行胸部X线检查,最后一周期化疗结束后2周复查胸部CT、头部MR I、腹部B-US和全身同位素骨扫描。参照WHO实体瘤评价标准,盲法评价化疗效果,分为CR (完全缓解:病灶完全消失) 、PR (部分缓解:肿瘤缩小> 50% ) 、NC (无变化:肿瘤缩小< 50%或增大< 25% )和PD(进展:肿瘤增大> 25%或出现新病灶) ,以CR + PR计算有效率。
1. 4. 2 体外药物敏感性评价:用荧光测定仪自带分析软件计算抑制率,并进一步计算出杀伤50%、90%肿瘤细胞所需药物浓度IC50和IC90 。根据Kurbacher等的标准,将药物对肿瘤的作用分为4个级别: (1)高度敏感( SS) : IC50 ≤25% PPC和IC90 <100% PPC; (2)中度敏感( IS) : IC50 ≤25% PPC和IC90 ≥100%PPC; (3)轻度敏感(MS) : IC50 > 25% PPC和IC90 < 100% PPC;(4)耐药(R) : IC50 > 25% PPC和IC90 > 100% PPC。体外有效=SS + IS,体外无效=MS +R。
1. 4. 3 病理学疗效:对两组经新辅助化疗后手术切除的标进一步行病理学疗效评价,参照易祥华等的标准分4级: Ⅰ级:肉眼及镜下均无肿瘤组织或肿瘤消失,可见纤维组织增生,即组织学完全缓解; Ⅱ级:肉眼未见肿瘤,镜下见肿瘤残留; Ⅲ级:肿瘤体积较小,边界清楚,明显坏死、变性伴纤维化,但仍有活跃生长的癌细胞; Ⅳ级:肿瘤组织明显侵袭,细胞增生活跃,形态与未经化疗者相似,或仅见轻度变性坏死。以Ⅰ级+ Ⅱ级为化疗有效。
1. 5 统计学处理 应用SPSS 10. 0软件对数据进行统计学处理,计量资料比较采用t检验,计数资料比较采用χ*2 检验,以P< 0. 05为差异有统计学意义。
2 结 果
2. 1 体外肿瘤化疗药敏结果 试验组共收集标本40例, 3例因细胞数不够,放弃培养,标本可评估率为92. 5% ( 37 /40) 。四组化疗方案的体外有效率依次为: GP 组81. 1% , DP 组78. 4% ,NP组62. 2%及TP组59. 5% (见表1) ,以GP组最高,但与各组比较差异无统计学意义( P > 0. 05) 。不同肺癌个体对四组化疗方案敏感性不同。结果表明大部分NSCLC对第三代含(顺)铂化疗方案有较高的敏感性,但仍筛选出5例体外无效者未行新辅助化疗,直接手术2例,放射治疗2例,靶向治疗1例。
2. 2 两组临床结果比较 试验组根据体外肿瘤化疗药敏结果行新辅助化疗32例,其中GP组11例,DP组10例,NP组5例及TP组6例,平均化疗2. 06周期,临床疗效评价CR 3例, PR22例,NC 7例,无PD,有效率78. 1% (25 /32) 。所有32例均于化疗结束后3 ～4 周进行手术,完全切除率93. 8% ( 30 /32) 。对照组39例均行经验性新辅助化疗,其中GP组12例, DP组14例,NP组6例及TP组7例,平均化疗1. 95周期,临床疗效评价无CR, PR 25例, NC 10 例, PD 4例,有效率64. 1% ( 25 /39) ; 4例PD者未行手术,其余35例化疗结束后3～4周行手术治疗,完全切除率82. 9% (29 /35) 。两组化疗有效率及手术完全切除率比较差异无统计学意义(χ*2 = 1. 66, P > 0. 05;χ*2 =1. 88, P > 0. 05) 。
2. 3 两组病理学疗效比较 对两组经新辅助化疗后手术切除的标本进一步行病理学疗效评价,试验组Ⅰ级2 例, Ⅱ级23例, Ⅲ级6例, Ⅳ级1例,有效率78. 1% ( 25 /32) 。对照组无Ⅰ级, Ⅱ级19例, Ⅲ级10例, Ⅳ级6例,有效率54. 3% ( 19 /35) 。两组病理学疗效有效率比较差异有统计学意义(χ*2 = 4. 21, P <0. 05) 。
3 讨 论
肺癌在世界范围内是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,外科手术是主要的治疗手段,术后5 年生存率22. 9% ～47. 3% ,失败的主要原因多为术前已有潜在的微小转移灶。由于新辅助化疗的介入,部分Ⅲ期患者的治疗效果得到提高,并有逐渐借鉴到Ⅰ～Ⅱ期患者的趋势,其总的有效率在36%～79%之间,化疗方案的选择均为经验性,由于肿瘤细胞的异质性,不同个体对化疗药物的敏感性存在差异,导致经验性新辅助化疗效果尚不理想,并可能因化疗无效而丧失有可能治愈的手术机会。因此,寻找一种有效的肿瘤药物敏感性的筛选方法,以指导个体化化疗是改善肺癌患者预后的有效途径之一。1983年Moyer等提出内源性ATP的数量可以反映细胞的活性度,随后Kangas等相继证实该技术是一种敏感而可靠的确定各种细胞活性度的检测方法。ATP-TCA技术通过测定细胞内源性ATP的含量来评估化疗药物对肿瘤细胞的杀伤效果,与其他几种体外药敏测技术相比较,具有较高的灵敏性和特异性,可重复性好,成功率达90% ～96%。其最大的特点是非常敏感,最低可检测10～250个细胞,从而大大降低了药敏试验对细胞的需求量。有报道内窥镜活检标本即可完成5种抗癌药物的药敏检测。国外已经将其应用于卵巢癌和乳腺癌化疗药物筛选,结果显示:该法与临床相关性较好,敏感性达90%以上,特异性为86%～100%。依据ATP-TCA指导的临床用药在临床及病理组织学疗效、5年生存率和无进展生存率方面明显优于常规经验用药,并可作为化疗耐药及复发的预测指标,该技术的应用大大提高了肿瘤治疗的疗效和针对性。我院邹青峰等应用ATP-TCA系统指导制定中晚期肺癌的化疗方案,取得初步结果。本研究进一步利用ATP-TCA 系统对40例Ⅱ～Ⅲ期NSCLC患者进行体外药敏检测,可评估率92. 5% ,结果显示其对第三代含(顺)铂化疗方案的敏感性达59. 5%～81. 1% ,不同个体对四组化疗方案的敏感性存在差异,体现了肿瘤的异质性,并筛选出5例( 12. 5% )对四组化疗方案均不敏感的患者。根据体外药敏检测结果选择个体化新辅助化疗方案的试验组,化疗有效率78. 1% ,手术完全切除率93. 8% ,高于对照组的64. 1%和82. 9% ,两组比较差异无统计学意义。但对两组经新辅助化疗后手术切除的标本进一步行病理学疗效评价,试验组有效率78. 1% ,对照组54. 3% ,差异有统计学意义,与临床疗效评价不完全一致, Junker等的研究也有类似结。推测由于影像学检查的局限性,将原发灶中炎症吸收消散误认为肿瘤缩小,而肿瘤细胞的变性坏死和纤维增生不表现为肿瘤缩小,提示病理组织学疗效评价可以更客观真实地反映化疗的效果。
综上所述,对Ⅱ～Ⅲ期NSCLC患者,根据ATP-TCA药敏检测结果指导选择性新辅助化疗,结合病理组织学疗效评价新辅助化疗效果,剔除不能从化疗中受益的患者,达到NSCLC治疗的个体化,可望提高化疗疗效,减少无效化疗而降低毒副作用的发生,从而改善患者预后,确切的结论尚需进一步积累病例资料和远期随访观察。鉴于NSCLC新辅助化疗前难以取得较大的瘤体标本,本研究仅对四种第三代含(顺)铂化疗方案进行药敏检测,其他的更多单药及化疗药物组合的敏感性有待进一步研究。
