笃斯越桔果实总DNA提取方法的比较研究

作者：王程，罗 军，田志杰，姜艳霞，李 妍，许 娜，芦晓晶，吕士杰   
作者单位：吉林医药学院生物化学教研室，吉林 吉林

【摘要】  目的 探讨越桔果汁总DNA的最佳提取方法。方法 分别采用SDS法、高盐低pH值法、CTAB法、异硫氰酸胍法提取越桔果汁的基因组DNA，并对其进行核酸含量测定和电泳及RAPDPCR检测。结果 SDS法、高盐低pH值法、CTAB法、异硫氰酸胍法提取越桔果汁的基因组DNA其OD260/OD280分别为1.944、1.738、1.661、1.813，其浓度分别为2.363 μg/μl、0.548 μg/μl、0.735 μg/μl、1.455 μg/μl；电泳检测显示异硫氰酸胍法提取DNA条带最清晰，扩增产物最多。结论 用异硫氰酸胍法提取越桔果汁总DNA优于其它方法。

【关键词】  越桔；DNA提取；SDS法；高盐低pH值法；CTAB法；异硫氰酸胍法

 Comparative study on extracting DNA from blueberry

    WANG Cheng,LUO Jun,TIAN Zhijie,JIANG Yanxia,LI Yan,XU Na,LU Xiaojing,Lü Shijie  （Department of Biochemistry,Jilin Medical College,Jilin City,Jilin Province,132013,China）

    Abstract:Objective  To acquire an efficient method of extracting DNA from processed blueberry juice. Methods  DNA was extracted by SDS,High salty low pH value buffer,CTAB and Guanidinium thiocyanate respectively,the quality and quantity of extracted DNA were analysed by spectrophotometer，electrophoretic and RAPDPCR. Results  OD260/OD280 of blueberry juice genome DNA respectively extracted by SDS,High salty pH value buffer,CTAB and Guanidinium thiocyanate extraction was 1.944，1.738，1.661，1.813，the density was 2.363 μg/μl，0.548 μg/μl，0.735 μg/μl，1.455 μg/μl. Conclusion  Guanidinium thiocyanate was better than all the other methods.

    Key words:blueberry;DNA extraction;SDS;High salty low pH value buffer;CTAB;guanidinium thiocyanate

    笃斯越桔(Vaccinium uliginosum L.)又名蓝莓(blueberry)、地果、甸果、都柿等，隶属杜鹃花科越桔属，为亚灌木野生植物。越桔属全世界共有400多种，中国约有90余种［1］，主要集中在东北、内蒙古、新疆等地区，吉林省长白山地区野生笃斯越桔分布极广，产量大，资源丰富。当前，对笃斯越桔研究主要热点集中在治疗腹泻、痢疾、口腔炎症、眼科疾病、血管障碍和糖尿病并发症等。本研究对野生和人工栽培的笃斯越桔分别采用异硫氰酸胍法、CTAB法、SDS法和高盐低pH法提取果实总DNA进行比较，以建立适宜笃斯越桔果实总DNA的提取方法，并为笃斯越桔的基因多态性比较奠定基础。

    1  材料与方法

    1.1  样  品

    均为低温冷冻品野生笃斯越桔，采自吉林省安图县，由吉林医药学院药学院雷钧涛副教授鉴定。

    1.2  仪器与试剂

    PTC240VAC型PCR仪(美国MJR公司),3K30型低温高速离心机(美国sigma公司)，EC25090型电泳仪(美国ECApparatas公司)，DDYIII34A型电泳槽(北京六一公司)，756MC型紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂)等。

    十二烷基磺酸钠(SDS)提取缓冲液：100 mmol/L TrisHCl(pH 8.0)，50 mmol/L EDTA，20％SDS，500 mmol/L NaCl，10%体积比β巯基乙醇(βME)；

    十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取缓冲液：100 mmol/L TrisHCl(pH 8.0)，10 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，1.4 mol/L NaCl，3％CTAB，1％聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)；

     高盐低pH值提取缓冲液：100 mmol/L NaAc(pH 4.8)，50 mmol/L EDTA，1%SDS，500 mmol/L NaCl，10%体积比βME；

    异硫氰酸胍提取缓冲液：5 mol/L异硫氰酸胍，4 mol/L NaClO4(pH 5.2)。

    RAPD引物、dNTPs、Taq酶、RNase A、Marker均购于北京鼎国生物技术服务有限公司；试剂均为国产分析纯。

    1.3  DNA提取的方法

    SDS法按参照文献［23］略加改进如下，取约3 g果实加2 mol/L NaCl 10 ml均浆至所有细胞破裂，取300 μl果汁样品放入1.5 ml Ep管内，加SDS提取缓冲液800 μl，匀浆成糊状，65℃水浴20 min，取出降至室温后加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，上下轻缓混合，12 000 r/min离心10 min，小心取出上清液。转移入一新的 1.5 ml Ep中，加入40 μl RNase A(100 pg/ml)，再加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，上下轻缓混合，室温放置20 min，12 000 r/min离心10 min，将上清液转移入另一新的1.5 ml Ep中。加入1/10体积3 mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇(两者均提前放置于-20℃下10 min以上)，充分混匀，-20℃放置15 min，12 000 r/min 离心10 min，弃上清液。加入1 ml 70％乙醇洗涤沉淀，12 000 r/min离心5 min，弃上清液，重复洗涤3次，将沉淀在超净工作台上吹干，加入50 μl灭菌双蒸水溶解沉淀，轻缓混匀，-4℃保存待用。

    高盐低pH值法除将SDS提取缓冲液用高盐低pH值提取缓冲液代替外，其余均按SDS法操作。

    CTAB法除将SDS提取缓冲液用CTAB提取缓冲液代替外，其余均按SDS法操作。

    异硫氰酸胍法除将SDS提取缓冲液用异硫氰酸胍提取缓冲液代替外，其余均按SDS法操作。

    1.4  DNA样品的检测

    1.4.1  琼脂糖凝胶电泳检测

    取5 μl DNA样品，加入3 μl灭菌双蒸水，再加入2 μl样品缓冲液，混匀后加入点样孔。在1.5％琼脂糖(溴化乙锭染色)凝胶上电泳。

    1.4.2  紫外消光值检测

    将提取得到的DNA样品每份吸取10 μl，用双蒸水稀释至1.5 ml分别标记。用双蒸水作空白对照校0点，然后取各样品DNA 稀释液1．5 ml在紫外分光光度计上测定，分别测OD230、OD260、OD280 值。核酸浓度按如下公式计算：DNA样品的浓度(μg/μl)=OD260×核酸稀释倍数(150倍)×50/1000；核酸纯度的估计：纯DNA样品OD260/OD280紫外消光值应为1.8，如果OD260/OD280值大于1.9，表明有RNA污染，小于1.6，表明样品中存在蛋白质或酚污染。OD260/OD230值应大于2.0，如果OD260/OD230值小于2.0,表明溶液中有残存盐和小分子杂质,如核甘酸、氨基酸、酚等。

    1.4.3  RAPDPCR检测

    以随机引物F05，序列为：5′CCGAATTCCC3′，进行RAPDPCR反应。反应体系25 μl。反应程序：94℃预变性4 min；94℃ 40 s，37℃ 45 s。72℃ 80 s，42个循环；72℃，8 min。扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶(溴化乙锭染色)电泳。

    2  结  果

    2.1  琼脂糖凝胶电泳检测结果

    电泳结果见图1。图1的序号1～4分别对应SDS法、高盐低pH值法、CTAB法、异硫氰酸胍法提取越桔果汁的基因组DNA，M为Marker。从结果来看，四种方法均可看到有明显的DNA条带，1、2条带较宽，可能有DNA断裂现象，3、4号条带较整齐，基因组DNA较完整。

     2.2  紫外消光值检测结果

    分别用紫外分光度计检测结果如表1所示。由表1可见，四种方法OD260/OD280＞1.6，均没有较多的蛋白质合分类污染。SDS法所得的总DNA的浓度较大，为2.363 μg/μl，但OD260/OD280＞1.9，OD260/OD230＜2.0，说明有较多的RNA和残存盐和小分子杂质；高盐低pH值法所得的总DNA中含RNA较少，但有残存盐和小分子杂质，并且浓度较低，只有0.548 μg/μl；CTAB法和异硫氰酸胍法所得的总DNA中含RNA、残存盐和小分子杂质都较少，更适合扩增实验。异硫氰酸胍法所得的总DNA浓度较CTAB法大，为1.455 μg/μl。表1  紫外分光光度法检测各种抽提方法提取越桔果汁总DNA比较

    2.3  RAPDPCR检测结果

    电泳结果见图2。图2的序号1～4分别对应SDS法、高盐低pH值法、CTAB法、异硫氰酸胍法提取越桔果汁的基因组DNA扩增后的产物，M为Marker。从结果来看，四种方法均可看到有2条DNA扩增条带，分别约为1 800 bp和1 400 bp，说明这四种方法均适合RAPDPCR扩增。

　　3  讨  论

    目前，植物组织中DNA主要在叶片中进行提取，徐娜等［4］已确立了从越桔叶片中提取DNA的快速方法，但在果汁中尤其在浆果果汁中提取DNA鲜见报道，沈夏艳等［5］在苹果汁提取DNA，取得了较好的效果。DNA的提取和纯化是进行RAPD扩增的首要步骤，DNA质量的好坏直接关系到实验的成败。本实验分别采用SDS法、高盐低pH值法、CTAB法、异硫氰酸胍法提取果汁样品总DNA，SDS法所得的总DNA的浓度较大，但高盐低pH值法所得的总DNA的浓度较小；CTAB法效果较好，但所用试剂较昂贵；异硫氰酸胍法所得的总DNA的质量好，浓度大，残存盐和小分子杂质也少，故提异硫氰酸胍法是提取果汁中DNA的首选方法。实验中如何去除果汁中特有的影响DNA提取的物质，是选择果汁DNA提取方法应重点考虑的问题。用酚氯仿沉淀蛋白，交替使用酚、氯仿两种不同的蛋白质变性剂以去除与核酸结合的蛋白质等生物大分子的干扰，提越桔果汁DNA的纯度，且提取的DNA适合于PCR扩增和RAPD反应。此外，由于果汁中所含的多糖、多酚、单宁、色素及其它代谢物质均会对DNA的提取产生影响，如多酚等物质可使DNA氧化成棕褐色，多糖与DNA结合成粘稠的胶状物，而且加工中出现的某些物理、化学变化及酶因子也会影响DNA的质量。因此，本实验采用多次加酚去除果胶、多糖也取得较好的效果。采用果胶酶处理，并在DNA提取液中加入PVP及EDTA螯合物，也是可借鉴的改善模板质量的方法。本实验建立了一套较为完整的越桔RAPD的优化反应体系及程序,为今后分析不同品种越桔居群及居群间的遗传多态性奠定了基础。

【参考文献】
［1］ 刘淑兰,吕秀莲,王晓军，等.越橘的化学成分与药理活性研究进展［J］.中医药学报，2006，34(6):5354.

［2］ 丛 娟，晓 玲，宫 莉，等.菠菜基因组DNA提取方法与条件的研究［J］.长春工业大学学报：自然科学版，2007，28(4):467472.

［3］ 李晓红，陈世义，钟淑霞，等.研磨CTAB法与碱性异硫氰酸胍沸腾法提取真菌DNA的比较分析［J］.中国实验诊断学，2005，9(3)：364365.

［4］ 徐 娜，夏秀英，徐大可，等.越橘基因组DNA的快速提取及分析［J］.果树学报，2007，24(5)：714717.

［5］ 沈夏艳，陈 颖，黄文胜，等.苹果汁中DNA提取方法的比较及RAPD扩增研究［J］.中国食品学报，2008，8（2):1822.