（本文作者：解放军总医院全军肾脏病研究所 吴镝）
人类基因组DNA 序列图谱初步完成后, 如何将疾病与基因异常相关联起来, 已成为科研人员关注的焦点。肾脏疾病是遗传因素( 基因组信息) 与环境因素相互作用的结果, 一般分为3 种: 单基因病(如多囊肾病) 、多基因病(目前临床上的肾脏疾病多数属于此类) 和获得性基因病( 主要是传染性疾病病原微生物通过感染方式将自身基因侵入到宿主基因引起) 。由于生物学相关技术的突飞猛进, 使基因功能研究能够规模化、快速化, 因而对某个基因的功能检测也更趋向可视化, 如各种荧光蛋白的广泛应用。如能整合这些最新技术并将其应用到肾脏疾病的研究中, 将会使该领域有更大的突破。本文对最近一些新技术及利用这些技术发现的、可导致肾脏疾病的相关异常基因, 作一概述。
模式生物在肾脏疾病研究中的应用
在人类基因组的研究中, 模式生物体的研究占有极其重要的地位。尽管模式生物体的基因组结构相对简单, 但其核心细胞过程和生化通路在很大程度上是保守的。这项研究为大规模测序、大规模表达谱检验、大规模功能筛选及基因组进化等提供了重要线索。目前常用的模式生物有如下几种。
1. 斑马鱼(zebrafish): 该鱼种1 d 内可成长到人类胚胎1 个月时的状态。斑马鱼中枢神经系统、内脏器官、血液及视觉系统, 在分子水平上85%与人相同, 尤其是心血管系统, 早期发育与人类极为相似。斑马鱼的表型可使用简单的光学显微镜进行观察, 从而可进一步利用转基因技术使绿色荧光蛋白在特异性组织或器官上表达, 利于检测与观察。如多囊肾疾病基因PKD 的研究中, 就是通过囊肾表型的斑马鱼突变体模拟而获得进展, 也有人利用斑马鱼进行肾小管坏死的研究。
2. 黑腹果蝇(Drosophila melanogaster): 这是一种体长约3 mm 的昆虫。其作为模式生物的优势主要有体积小、易操作、饲养简单、成本低廉、生命周期短(约2 周)及便于进行表型分析等。目前利用果蝇对肾脏疾病的研究较少, 主要是在肾脏发育的方面。
3. 线虫(Caenorhabditis elegans): 构造简单, 生长快速, 可大量养殖, 易产生基因突变。此外其细胞数目及细胞命运图谱几乎固定, 并易于追踪。细胞凋亡的调控机制在各种动物中均类似, 而这些知识主要来自于线虫的研究。最近在对线虫研究中发现的瞬间受体电位( TRP) 通道与人多囊肾病基因密切相关。
4. 小鼠实验操作工具: 由于小鼠基因组与人类基因组高度同源, 小鼠基因组改造手段非常成熟及小鼠近交系、突变系和工具小鼠品系种类繁多, 小鼠遗传学已成为发育生物学、功能基因组学和疾病机制研究的核心研究领域。基因敲除鼠在近年的基因功能研究中起了举足轻重的作用。与肾脏疾病及其关键的一些基因如nephrin 等, 都有相应的基因敲除鼠, 使肾小球上皮细胞( 足细胞) 研究有了飞跃式进步。其他还有转基因小鼠技术、“人化小鼠”技术( 用人染色体片段取代小鼠相应的染色体区域)及大规模诱变技术。目前大规模诱变技术已经有商品化鼠系, 如Lexicon Genetics 公司已建立了2 万个含有病毒插入特定基因从而破坏基因功能的ES 细胞株, 用这些ES 细胞株可培育成小鼠, 并从表型分析来确定突变基因。其余一些公共鼠系库也可申请使用。
微小RNA(miRNA) 与小干扰RNA( s iRNA)RNA 一度被认为仅是DNA 和蛋白质间的“过渡”, 但越来越多的证据表明, RNA 在生命进程中扮演的角色远比研究者预先设想的更重要。RNA干扰(RNA interference) 的发现使人们对RNA 调控基因表达的功能有了全新认识, 更可简化、替代基因敲除而成为研究基因功能的有力工具。
miRNA 和siRNA 很容易混淆, 两者有许多共同点, 也有许多不同点。共同点: ①都是由22 个左右的核苷组成; ②都是Dicer 酶的产物; ③在起干扰、调节作用时都会与RNA 诱导沉默复合物(RISC)结合; ④都可在转录后和翻译水平干扰以抑制靶标基因的翻译。两者不同之处在于miRNAs 在物种进化中相当保守, 主要在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用; siRNAs 相似于miRNAs, 但是其前体是完整的双链RNA, 以外源性为多。siRNAs能调控转录后修饰及表观基因组修饰。
在对肾脏疾病的研究中发现, miRNA-192 在糖尿病肾病的肾小球和转化生长因子-β( TGF-β) 诱导胶原表达过程中可通过抑制E-box 盒起重要作用。基因扫描技术(Genescan)这是一种用途广泛的DNA 片段分析技术, 是在测序仪上对荧光标记的DNA 片段的大小、数量进行分析检测的过程。被广泛运用于短串联重复标记( STR, 即微卫星标记) 分析、单链构象多态性分析( SSCP) 、扩增片段长度多态性(AFLP) 作图等。根据研究者对基因组不同区域的关注, 大致可将基因扫描分为全基因组扫描和部分基因组扫描2 类。该方法对肾脏疾病家系分析必不可少。
Bisceglia 等利用全基因组扫描技术, 对22 个IgA 肾病家族共186 人进行了基因型扫描( 其中59例患者, 127 名健康者) , 包括进行二期全基因组连锁分析, 结果发现4q26-31 与17q12-22 有很强的连锁相关性, 为临床IgA 肾病家族的遗传异质性提供了证据。美国Wake Forest 大学医学院利用基因扫描等技术发现了与系统性红斑狼疮及其相关自身免疫性疾病有关的基因———TREX1。TREX1 蛋白的功能就是分解或解开控制细胞内各种过程的遗传物质DNA。如果TREX1 蛋白不能将DNA 解链,身体就会产生针对DNA 的抗体, 从而导致狼疮等疾病。
基因组克隆技术
寻找正常人与患者间的差异基因及克隆可能导致病变的基因仍然是最基础的工作。随着人类及啮齿类动物等重要哺乳动物基因组测序的完成, 现在的工作重点已转移到功能基因组研究。目前的基因工程操作技术主要由如下几种: ①克隆已知序列的基因; ②功能克隆; ③作图克隆; ④表型差异克隆; ⑤利用表型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆基因。近年来基因芯片技术发展非常迅速, 国内外很多研究机构都已应用该技术发现了大量新的致病基因。解放军总医院曾应用该技术对衰老大鼠及青年大鼠的肾脏基因表达谱进行分析, 找到了热点基因。
表达谱差异分析技术在各领域的应用也得到了许多进展。Rudnicki 等利用基因差异显示技术, 结合肾活检后激光微切割技术, 分析蛋白尿患者和健康者肾小管上皮细胞的基因表达情况, 结果发现蛋白尿患者有168 个基因存在异常, 表达升高的基因包括细胞增殖、周期调控( IGF1 与Cdl34) 、分化( BMP-7) 、免疫反应、胞内运输和代谢类基因, 此外, 部分细胞黏附类基因表达下调, 如BH-protocadherin。这些基因可能在早期慢性肾脏病蛋白尿患者出现纤维化前或保护肾小管过程中起重要作用。
蛋白质组技术
蛋白质组研究中主要应用的技术包括双相电泳(2-DE)、新型质谱(MS)技术、数据库设置与检索系统等。不同发育、生长期和不同生理、病理条件下不同细胞类型的基因表达不一致, 因此对蛋白质表达的研究应精确到细胞甚至亚细胞水平。现可利用免疫组织化学技术达到这个目的, 但该技术的致命缺点是通量低。而激光微切割技术( LCM) 可精确地从组织切片中取出研究者感兴趣的细胞类型。取出的细胞用于蛋白质样品制备, 结合抗体芯片或二维电泳-质谱的技术路线, 可对蛋白质表达进行原位的高通量研究。有学者比较了2 型糖尿病尿白蛋白排泄正常与非正常( 各31 例) 美国Pima 印地安人的尿蛋白组谱, 确定了12 峰预测标记, 其预测糖尿病性肾病的灵敏度为93%, 特异度为86%, 准确度为93%。另一项报告提示, 尿蛋白组谱可预测蛋白尿正常的2 型糖尿病患者的糖尿病肾病。因此, 蛋白质谱在发现新的疾病标志蛋白中有着极大的优势。我国的北大医学院也利用此技术进行无创性肾脏疾病标志物的研究。
目前, 蛋白质芯片技术也日渐成熟, 已应用于蛋白质相互作用、蛋白表达和小分子蛋白结合研究。
其他相关技术
蛋白间的相互作用决定了蛋白的功能, 研究蛋白间相互作用的方法非常多, 如酵母双杂交、噬茵体展示、表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)、免疫共沉淀及pull-down 技术等。但同时这些研究手段也存在不少缺陷, 如酵母双杂交、磷酸化抗体、免疫荧光、放射性标记等方法应用的前提都是要破碎细胞或对细胞造成损伤, 无法做到在活细胞生理条件下实时对细胞内蛋白质-蛋白质间相互作用进行动态研究。而荧光能量转移( FRET) 技术的应用结合基因工程等技术正好弥补了这一缺陷。荧光共振能量转移是指2 个荧光发色基团在足够靠近时, 当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态, 在该电子回到基态前, 通过偶极子相互作用, 实现了能量向邻近的受体分子转移( 即发生能量共振转移) 。FRET 主要应用在检测酶活性变化、膜蛋白的研究、细胞膜受体间相互作用及细胞内分子间相互作用等。如Tamma 等利用FRET 技术, 分析了肾脏集合管细胞中cAMP 的动力学特点, 结果显示低渗环境能导致Actin 重排,从而引起细胞边缘应力纤维和结构F-actin 微丝丢失, 细胞出现肿胀。
生物信息学技术
生物信息学主要包括以下几个主要研究领域,序列比对( alignment) 、结构比对、蛋白质结构预测(包括2 级和3 级结构预测) 、计算机辅助基因识别(仅指蛋白质编码基因)、非编码区分析和DNA 语言研究等。迄今为止, 生物学数据库总数已达500 个以上, 在DNA 序列方面有GenBank、EMBL 和DDBJ等; 在蛋白质一级结构方面有SWISS-PROT、PIR 和MIPS 等; 在蛋白质和其他生物大分子的结构方面有PDB 等; 在蛋白质结构分类方面有SCOP 和CATH 等。但要充分利用这些资源, 需要较强的数学、生物学和计算机能力。
总之, 随着生物学各个领域的蓬勃发展, 如何充分利用这些新资源和技术扩展我们的思路, 使其服务于肾脏疾病的研究, 是摆在肾脏病学者面前的现实问题。这需要我们将眼光放得更开, 对交叉学科给予更多重视, 掌握这些技术的基本原理, 充分合作, 发挥各自优势, 就可得到事半功倍的效果。
