抗HIV1 Tat蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

作者：许晶
作者单位：第四军医大学微生物学教研室, 陕西 西安 710032
《细胞与分子免疫学杂志》2008年5月25卷5期 论著

【摘要】  目的: 制备抗HIV1 Tat蛋白的单克隆抗体（mAb）, 并对其进行初步鉴定。方法: 通过动物免疫、 细胞融合、 克隆化制备抗Tat蛋白的mAb, 并用ELISA法对所得mAb的特异性、 抗原识别表位及相对亲和力等做了初步鉴定。结果: 获得了3株抗Tat蛋白的mAb, 这3株mAb均能特异识别Tat蛋白。结论: 获得了3株杂交瘤细胞系, 均可以稳定分泌抗HIV1 Tat蛋白的mAb, 有望为HIV早期检测及HIV抗病毒治疗提供有用工具。 

【关键词】  HIV1 Tat 单克隆抗体

　　自1981年发现艾滋病以来, 艾滋病（acquired immunodeficiency disease, AIDS）在全球迅速扩散, 人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,  HIV）是引起AIDS的病原体。HIV有许多结构蛋白以及调节蛋白, 其中Tat蛋白是很重要的调控蛋白之一,  是HIV基因复制和表达调控所必需的［1］。Tat蛋白由2个外显子编码, 其中第1个外显子编码l～72位氨基酸残基, 第2个外显子编码73～101位氨基酸残基。由第1个外显子编码的72个残基的肽段具有完全的体外反式激活活性。Tat是HIV最早产生的病毒蛋白之一, 其入核后通过结合HIV长末端重复序列和反式激活效应元件, 进一步促进病毒RNA的产生, 是病毒复制的重要激活分子［2］。本研究中通过免疫BALB/c小鼠获得Tat蛋白的单克隆抗体（mAb）, 并用ELISA等方法检测mAb的性质, 为HIV早期检测以及抗病毒治疗提供了新的思路。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料 

　　纯化的Tat蛋白由美国丹佛大学惠赠。BALB/c小鼠（6～8周龄）购买第四军医大学实验动物中心。小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0为本试验室保存。RPMI1640干粉培养基购自Gibco公司。小牛血清购自四季青公司。酶标山羊抗小鼠IgG抗体购自TaKaRa公司。小鼠Ig亚类检测试剂盒、福氏佐剂及PEG购自Sigma公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  动物免疫 

　　取Tat蛋白28  μL, 加0.02 mol/L的PBS(pH7.4) 1.472  mL使成1.5 mL浓度溶液, 加等量福氏完全佐剂用三通器混匀制成油包水的乳化液。在5只BALB/c小鼠的颈背部及双侧腹股沟皮下多点注射, 剂量为0.6 mL/只, 间隔3周后以同样方法(加不完全福氏佐剂乳化)免疫, 再间隔2周后取等量蛋白溶于生理盐水中经腹腔进行第3次免疫, 最后1次免疫2周后测小鼠血清效价, 选择血清效价高的小鼠再经腹腔加强免疫, 3 d后取脾细胞进行融合。

　　1.2.2  mAb细胞株的建立 

　　取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合, 融合剂为相对分子质量（Mr）1 500的PEG。细胞融合及选择性培养均按常规方法［3］进行。以10 mg/L的Tat蛋白包被聚苯乙烯微板, 用间接ELISA法检测杂交瘤细胞培养上清, 以正常BALB/c小鼠血清作为阴性对照, 以免疫BALB/c小鼠血清作为阳性对照。采用有限稀释法对检测阳性孔细胞进行3次克隆化, 直到克隆生长孔mAb阳性率达100％, 建立单克隆细胞株。将阳性杂交瘤细胞株扩增培养后液氮冻存。

　　1.2.3  mAb腹水的制备及其效价测定 

　　取建株的杂交瘤细胞扩大培养后, 以1×106个细胞接种于已注射石蜡油的BALB/c小鼠腹腔中, 按常规法收集、 制备mAb腹水［3］。以上述间接ELISA法检测mAb腹水效价。

　　1.2.4  mAb的纯化 

　　采用正辛酸硫酸铵法对小鼠腹水中的mAb进行纯化［3］。

　　1.2.5  mAb的特异性鉴定不同多肽检测mAb腹水 

　　分别取Tat、 Gp415多肽及Bcsp31蛋白, 以20 mg/L浓度包被微板, 用间接ELISA法检测抗Tat蛋白的mAb腹水(分别以正常鼠血清为阴性对照)。

　　1.2.6  Ig类和亚类的鉴定

　　采用小鼠Ig类检测试剂盒对所获得的mAb进行鉴定,  具体方法参照试剂盒中的说明书进行。

　　1.2.7  mAb相对亲和力的测定

　　采用间接ELISA法测定［4］。以10 mg/L的浓度包被Tat蛋白, 加入系列稀释( 200 mg/L至10-8mg/L)的纯化mAb, 再加入HRP标记的羊抗鼠IgG, OPD显色后测定492 nm处的A值。以抗体浓度为横坐标, 以A492为纵坐标, 绘制曲线, 观察相对亲和力。

　　1.2.8  抗体相加实验分析mAb针对的抗原表位

　　确定各mAb反应饱和浓度后, 将各株mAb稀释至100 mg/L (该浓度均大于各mAb反应的饱和浓度)。以2 mg/L浓度包被Tat蛋白, 分别将各株mAb两两相加后加入微孔板, 另外各有一孔只加单独一种mAb。再加入酶标羊抗鼠IgG, 并经显色后测定492 nm处A值。相加指数按公式AI=［ 2A1+2/(A1+A2)-1］×100％计算。公式中A1和A2分别为单独加1株mAb的A值, A1+2代表2株mAb相加所测得的A值。AI大于50％表示具有相加效应, 提示2株mAb针对不同抗原表位; AI在10％～50％之间表示2株mAb针对的抗原表位可能有差异; AI小于10％则表示2株mAb针对的抗原表位相近。

　　2  结果

　　2.1  抗Tat蛋白mAb杂交瘤细胞株的建立

　　经小鼠免疫、 细胞融合、 筛选及克隆化, 共获得抗Tat蛋白的阳性克隆3株, 每株分别进行3次克隆化后得到可以稳定分泌mAb的杂交瘤细胞株, 分别命名为A10、 E2和C10。将3株杂交瘤细胞置液氮中冻存, 3个月后复苏培养, 杂交瘤细胞生长良好。测定其培养上清, 效价与冻存前相接近, 证明此杂交瘤细胞株经液氮冻存之后, 仍可保持稳定分泌mAb的能力。

　　2.2  腹水及纯化mAb效价测定

　　上述3株mAb（A10、 E2和C10）腹水经纯化后的mAb浓度为0.263 g/L、 1.689 g/L、  0.908 g/L, 经ELISA法检测其腹水效价均为1∶200, 纯化mAb的效价分别为1∶3 200、 1∶800、 1∶1 600。

　　2.3  mAb特异性鉴定

　　ELISA检测的结果表明, 上述3株mAb（A10、 E2和C10）均与Tat蛋白有特异性反应,  与Gp415多肽和Bcsp31蛋白均不反应(表1)。表1  不同多肽对不同mAb的ELISA检测（略）

　　2.4  mAb亚类鉴定
 
　　A10、 E2和C10都为IgG2b亚类。

　　2.5  mAb相对亲和力的测定

　　根据间接ELISA法检测系列稀释的mAb与Tat蛋白反应的A值绘制曲线(图1), 以抗原抗体结合平台期50％A值的抗体浓度表示mAb的相对亲和力, 其相对亲和力为: E2>A10>C10。

　　2.6  mAb识别表位检测

　　确定抗原抗体反应饱和浓度后。对3株mAb进行两两相加并检测, 按公式AI=［ 2A1+2/(A1+A2)-1］×100％计算。得出AI1(E2+C10)=［2×0.394/(0.231+0.226)-1］×100％=72.4%;  AI2(A10+C10)=［2×0.442/(0.443+0.226)-1］×100％=32.1％; AI3(E2+A10)=［2×0.404/(0.231+0.443)-1］×100％=31.2% 。从结果可以看出, 所得的3株mAb中A10与E2、 C10针对的抗原表位有差异; E2与C10针对不同的抗原表位。

　　3  讨论

     Tat蛋白这种多功能蛋白不仅可以通过反式激活效应调控病毒基因的复制与表达,还可以诱导细胞凋亡, 激活静态T淋巴细胞, 抑制免疫细胞的分化和增殖［5］, 有助于病毒的感染和体内传播以及导致各种并发症等作用［6］。目前, 有很多关于Tat蛋白极其相关性质的研究, 并制备出了Tat蛋白的多克隆抗体, 应用于HIV检测［7］。

　　本研究中, 我们采用常规方法制备了针对Tat蛋白的杂交瘤细胞株。这3株杂交瘤细胞均能稳定分泌抗Tat蛋白的mAb, 并且这些mAb具有很高的特异性。Tat蛋白是人免疫缺陷病毒最早产生的蛋白之一, 可以将Tat蛋白的mAb应用于HIV的早期检测中, 及早发现体内存在的病毒。有研究发现, 在具有抗Tat抗体的HIV1血清转换者中, HIV疾病的进展相对缓慢, 抗Tat抗体可能有直接的保护作用,  因此,  Tat蛋白的mAb也将有望在抗HIV病毒治疗中提供有力的工具。

【参考文献】
　　［1］Chang HC, Samaniego F, Nair BC, et al. HIV1 Tat protein exits from cells via a leaderless secretory pathway and binds to extracellular matrix associated heparan sulphate proteoglycans through its basic region［J］. AIDS, 1997, 11: 1421-1431.

　　［2］黄文林. 分子病毒学［M］. 北京: 人民卫生出版社, 2002: 260-261.

　　［3］徐志凯. 实用单克隆抗体技术［M］. 西安: 陕西科技出版社, 1992: 31-41.

　　［4］肖 毅, 梅其炳, 候 颖, 等. 抗PHSA单克隆抗体相对亲和力的测定［J］. 细胞与分子免疫学杂志, 2005, 21（5）: 657-660.

　　［5］Gibellini D, Re MC, Vitone F, et al. Selective upregulation of functional CXCR4 expression in erythriod cells by HIV1 Tat protein［J］. Clin Exp Immmunol, 2003, 131(13): 428.

　　［6］Aoki Y, Tosato G. HIV1 Tat enhances Kaposi sarcomaassociated herpesvirus(KSHV) infectivity［J］. Blood, 2004, 104(3): 810.

　　［7］齐香荣, 张相民, 高瑛瑛, 等. HIV1 tat基因改造及其蛋白表达、 纯化与抗体制备［J］. 生物技术通讯, 2006, 17(2): 143-145.ISSN1007-8738细胞与分子免疫学杂志(Chin J Cell Mol Immunol)2008, 24(5)·论著·