（本文作者：中南大学湘雅二医院 郑煜煌）
高效抗逆转录病毒联合疗法( Highly ActiveAnti-ret roviral Therapy , HAART) 的出现,明显降低了人免疫缺陷病毒( human immunodeficiency vi-rus , HIV) 感染/ 获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmune deficiency syndrome ,AIDS) 相关性疾病的发病率和病死率,提高了HIV 感染者生存质量。但病毒耐药是HAART 中的一个十分棘手的问题,目前国内部分资料显示,针对不同类别的药物,HIV-1 的基因耐药率已达4 %～43 % ,明显影响到患者的治疗效果和预后。本文就HIV-1 基因耐药突变的近况进行简单介绍,并讨论我国目前的应对处理方法。
1 流行病学资料
1996 —2002 年,来自欧洲19 个国家,2 200 例新确诊感染HIV-1 的患者接受了耐药性检测,发现10 %的患者有基因型耐药,而且耐药率逐年增加,1996 —1998 年耐药率为2 % , 2000 —2001 年达8. 2 %。这些资料提示必须采取有效的措施以阻止HIV-1 耐药株的传播。2003 —2004 年,来自6 个国家89 个地区的787 例新感染HIV21 的感染者,其耐药性检测显示有14. 5 %的患者至少对1 种抗病毒药物耐药,7. 1 %的患者对核苷类逆转录酶抑制剂( Nucleaside reverse t ranscriptase inhibitors ,NRTIs) 耐药,8. 4 %的患者对非核苷类逆转录酶抑制剂( Nonnucleaside reverse t rascriptase inhibi-tor s , NNRTIs) 耐药,对蛋白酶抑制剂( Protease in-hibitor , PIs) 耐药者占2 % ,3 . 1 %的患者对2 种或3种抗病毒药物耐药。在我国,由于患者的经济条件受限等原因,接受正规治疗的人数较少或者疗程不规则,使得耐药发生的可能性大为增加。2005年,李韩平等对河南省118 例艾滋病患者进行基因耐药性分析,发现接受抗病毒治疗的患者中,有22 例产生对逆转录酶抑制剂的耐药性突变,突变频率为43. 14 %(22/ 51) ;未接受抗病毒治疗者中,8 例产生对逆转录酶抑制剂的原发耐药突变,即被耐药病毒株感染者表现出来的原发耐药,突变频率是22 . 22 %(8/ 36) 。2006 年,万卓越等对广东部分地区50 例从未接受HAART 治疗的HIV-1 感染者进行耐药性基因检测发现,对NRTI 和NNRTI 存在低、中度耐药相关突变者2 例(4. 00 %) ;无高度耐药相关突变者。此迹象值得我们高度重视,因为这可能对将来的大规模抗HIV/ AIDS 治疗产生一定影响。2007 年, 袁宏丽等对湖南省未接受HAART 治疗的HIV-1 感染者病毒耐药基因进行调查,在分离出病毒核酸的106 份样本中,仅检出1例存在PIs 主要耐药相关突变,但PIs 次要耐药相关突变却大量存在;有4 例出现一种NRTI 耐药突变, 1 例同时存在4 种NRTIs 相关突变:M41L 、M184V、L210W、T215 Y;另有4 例存在NNRTIs 耐药相关突变。
目前,在我国尚未治疗和已应用抗逆转录病毒治疗的患者中,病毒耐药性的产生已经达到一定程度,尤其是针对NRTIs 高度耐药性较为突出,迫切需要应用耐药性检测进行指导。
2 HIV-1 耐药性产生的机制
HIV 出现耐药是其基因的高度变异性和药物选择压力共同作用的结果。HIV-1 是RNA 病毒,具有高度的遗传变异性。逆转录酶( RT) 是参与HIV-1 复制的主要酶,它具有DNA 聚合酶的合成功能, 但不具有DNA 聚合酶的校正功能。在HIV-1的复制过程中,病毒核酸表现出高度的错误倾向性。突变率约为10 - 4 ～10 - 5 个碱基对/ 循环,即每天至少有104 个碱基突变。尤其在药物的作用下,会有选择地改变蛋白酶PR 和RT 部分位点上的氨基酸,从而产生耐药性。除此之外,基因重组也可进一步增加基因变异。耐药突变临床上可表现为病毒载量反弹,CD4 + 细胞下降。病毒基因耐药突变分为原发突变和继发突变。原发突变一般出现较早,一旦发生能明显降低病毒对药物的敏感性,而且每种药物有其相对特异的原发突变;继发突变通常发生在已经出现了原发突变的病毒基因组,能增强病毒的复制能力,对药物敏感性没有影响或影响很小。
3 NRTIs 的耐药突变
HIV 的RT 是由pol 基因编码的多功能异二聚体酶,它具有3 种酶的活性,即DNA 依赖的RNA聚合酶、DNA 依赖的DNA 聚合酶、RNA 聚合酶H活性。NRTIs 是第一种被批准的抗HIV 药物,对这类药物耐药的病毒变异也很广泛。此类药物目前包括齐多夫定(AZT) 、去羟肌苷(DDI) 、司他夫定(d4 T) 、拉米夫定(3 TC) 、阿巴卡韦(ABC) 、坦那夫韦( TNF) 、恩曲它宾( ETC) 和扎西它宾( zalcit-abine) 。此类药物能选择性与HIV 逆转录酶结合,并掺入延长的DNA 链中,使DNA 链延长中止,从而抑制HIV 的复制和转录。在接受单药治疗时,很容易出现HIV 突变。突变导致耐药的机制主要有2 种: (1) 链延长过程中,NRTI 的掺入减少; (2) 掺入的NRTI 水解增加,使得病毒继续复制。NRTI类耐药突变中,最先产生M184V 位点突变,然后产生胸腺嘧啶类似物( TAMs) 突变; TAM 突变是可预防的, 将会越来越少。现有6 种TAM 突变:M41L 、D67N、K70R、L210W、T215 Y/ F 和K219Q/ E/ N/ R ; 这些突变存在时将对所有的NR2TI 类交叉耐药,交叉耐药的程度随着TAM 突变数量的增加而增加。当M184V 突变同时存在时,TAM 突变将减慢。NRTI 类耐药突变途径有多种,在应用AZT 和D4 T 治疗时,先产生M184V 突变,后产生M41L 、L210W、T215 Y等TAMs 类突变或D67N、K70R、K219Q/ E/ N/ R 突变。前面的TAM突变途径对AZT 高度耐药,对多种NRTI 类交叉耐药。M184V 突变同时存在时,此类耐药程度轻度减少。D67N、K70R、K219Q 突变途径对AZT 低度耐药,交叉耐药少见;这种途径通常很少出现。当ABC、TNF 或DDI 与有TAM 类突变的3 TC 或F TC 联合应用时, 产生的突变是M184V、K65R、L74V , 将会对ABC、TNF 和DDI 产生不同程度的耐药,但是对胸苷类敏感。K65R 是对TNF 耐药突变的一个信号,它也出现在对ABC 耐药突变中;后者L74V 突变常见。携带M184V 突变基因的HIV21 病毒对3 TC 和F TC 高度耐药,当出现高度耐药时是否继续使用这类药物是一个争论的问题。近来体内和体外试验均显示,继续应用这类药物时,M184V 突变耐药株病毒复制的能力仍然减弱。把继续使用这类药物作为挽救性治疗方案的一种。
4 NNRTIs 的耐药突变
经FDP 批准的NNRTIs 类制剂有奈韦拉平(NVP) 、地拉韦定(DLV) 、依法韦伦( EFV) 。这3种药物不是通过链中止来抑制HIV21 的复制,而是选择性作用于RT 区的疏水区(NNRTI 变构部位的袋状结构) ,变构抑制临近的催化部位,使其失去活性或活性下降,从而抑制HIV 复制。袋蛋白发生突变时,将对NNRTI 迅速产生高度交叉耐药性,通常发生在选用NNRTI 单药治疗时。常见耐药突变发生在RT 区的98 、100 、103 、106 、108 、179 、181 、188 、190 氨基酸位点上,少见的突变位点有225 、236氨基酸位点。K103N 是常见的耐药突变,导致30～50 倍的耐药,并且对三种药均交叉耐药。Y181C/ I突变对DLV 和NVP 高度耐药,对EFV 低度耐药。有趣的是,在RT 区190 氨基酸位点的突变只对EFV 和NVP 耐药,而对DLV 高度敏感。近来文献报道,携带K101 P 突变基因或同时具有K103R和V179D 位突变的病毒对NNRTI 类高度耐药,而仅携带K103R 或V179D 突变基因的病毒对NNR-TI 类药物并没有产生有意义的耐药。Et ravirine 是一种新型的NNRTI 类药物,与其他同类药物相比,具有强力抗HIV-1 病毒的作用。此种药物的耐药方面与NVP 和EFV 显著不同。Et ravirine 的二期临床实验显示,其耐药性与NNRTI 位点突变的数量有关, 当Y181C、K101 P、V179 E/ F、G190S、M230L 位点联合发生突变时, 才产生对Et ra-virine10 倍以上的耐药。
5 PI 的耐药突变
HIV-1 蛋白酶是一个对称的二聚体,在该酶的催化下,HIV 由两种蛋白前体( Gag 多聚酶和GaG-Pol 多聚酶) 裂解为成熟蛋白,所以此酶对病毒的复制非常重要。PI 通过抑制蛋白酶即可阻断HIV 复制和成熟过程中所必需的蛋白质合成,从而抑制HIV 复制。目前FDP 批准的PI 有: 安普那韦(APV) 、茚地那韦( IDV) 、洛匹那韦(LPV) 、奈非那韦(NFV) 、利托那韦(RTV) 、沙奎那韦(SQV) 、atazanavir( ATV ) 、tipranavir 、darunavir 和fosamprenavir(GW433908 、908) 。与NNRTI 和NRTI 类药物相比,PI 类耐药突变发生比较慢,多个位点突变才产生完全耐药,交叉耐药比较少见,耐药突变具有药物特异性。例如,D30N 位点突变与NFV 有关,I50V 突变与APV 有关,G48V 和L90M突变与SQV 有关,I50L突变与ATV 相关。然而,蛋白酶其他位点如编码区82 、84 、90 位点突变将产生交叉耐药。
6 融合抑制剂的耐药突变
融合抑制剂是通过阻断病毒DNA 融合进入宿主细胞来抗病毒。融合抑制剂Enf uvirtide 耐药主要是gp41 外功能区上的HR21 区突变。突变的位点是G26 E、V38A 、V38 E、Q40 H 和N43D ,经常发生于接受Enf uvirtide 治疗的HIV21 感染者。发生耐药时,Enf uvirtide 的敏感性将减少10 倍以上,这些位点联合突变时,将会产生高度耐药性。V38 E位点突变对Enf uvirtide 的治疗影响最大,突变时,该药的敏感性减少1 000 倍以上。一项研究发现V38A 或V38 E 位点突变后,尽管病毒载量反弹到治疗前水平,但CD + 细胞持续上升。另外的体外试验发现,针对趋化因子受体( SCHD) 选择性耐药突变后,对vicriviroc 的耐药抵抗达20 000 倍以上。这些耐药位点突变后,对其他融合抑制剂仍然敏感,无交叉耐药。HIV21 对CCR5 受体抑制剂仍然敏感。
7 2006 年秋IAS2USA 耐药突变位点图
国际艾滋病学会美国分会( IAS-USA) 耐药突变组近6 年来作为独立和自愿的研究HIV-1 耐药突变位点的专家组,每年都在全球近期科研和临床实践最新数据的基础上公布各类各种抗HIV 药物的耐药突变图谱并加以说明,其目标是尽快和准确地把耐药突变信息传送给抗HIV 临床工作者。以下所载的2006 年9 —10 月版本IAS2USA 耐药突变位点图将取代2005 年9 —10 月以前发布的各个版本(表1) 。此图是为识别抗逆转录病毒耐药突变而设计的,并可作为治疗的指导,但在使用这个突变位点清单做监测或病毒耐药传染性的流行病学研究时必须谨慎,许多氨基酸位点的改变尤其是次要耐药,仅代表了基因的多态性,可能并没有反映先前药物的选择压力或降低了药物的敏感度。下面所载的新版本在NRTI 条中, E44D 和V118 I 突变被从对d4 T 和AZT 耐药的位点中删除,因为它们单独出现时对耐药的意义并不清楚。对NNRTI 的超敏性进行了更新,替诺福韦增加了K70 E 的耐药突变。在PI 部分,RTV 条目被排除是因为其现在只用于做药理学研究,并未作单一疗法的药物;阿扎那韦增加了以下的次要耐药: L10C、K20 T/ V、E34Q、F53L/ Y、I54A、I64L/ M/ V、V82 F/ I 及I93M ; 对SQV / RTV 的次要耐药新增加了以下位点:L24 I、I62V 和V82 F/ T/ S。
8 HIV-1 耐药性检测方法
HIV-1 耐药性检测方法主要有基因型分析和表型分析两种。基因型分析检测出的突变位点只提供了有关耐药的间接依据,而且耐药突变的类型多种多样,不同的突变组合及它们之间的相互作用对病毒表型均会产生不同的影响;而表型分析直接测定HIV-1 在不同浓度抗病毒药物存在时的复制增殖能力,根据其剂量- 反应曲线得到50 %抑制浓度(IC50 ) ,与标准参比毒株的IC50 相比以确定对药物的敏感性。
9 HIV-1 耐药突变的对策
HIV-1 治疗出现耐药突变的临床表现是病毒学失败,即在病毒载量下降后又重新上升,CD4 + 细胞下降或维持原水平。当病毒学失败时,应区别有限或广泛药物耐药,考虑先前治疗史及先前耐药试验结果。(1) 有限先前治疗和药物耐药:此时的目标是最大限度再抑制HIV RNA 水平及预防耐药突变的进一步选择。因有病毒学失败,应考虑尽快改变治疗方案,以减少耐药突变的继续选择。在方案中至少调换2 种药物成活性药物(B II) 。可考虑单个药物替代(基于耐药试验) ,但未被证实(CIII) 。(2)广泛先前治疗和药物耐药:在这一人群中,病毒抑制常难于达到。因此,目标为保存免疫功能和预防临床进展(即使病毒血症持续) 。即使只是HIV RNA部分病毒学效果,病毒抑制基线仅下降> 0 . 5 lg 拷贝/ mL ,亦有相关的临床好处。但这有平衡累积增加的耐药突变持续不断的危险。有理由在相同方案基础上观察患者,而不是改变方案(根据HIV 疾病的时期,如果无治疗选择的话) 。队列研究中有证据表明,继续治疗即使是存在病毒血症和未见CD4 细胞计数增加,仍可使疾病进展的危险下降。
HIV-1 出现耐药突变后,意味着抗病毒治疗失败。由于目前国家免费提供的抗病毒药物种类非常有限,取得治疗成功的关键是有一个好的治疗支持系统,尽可能保证一线方案的成功率,除非可获得更多的药物,而目前在国家免费治疗工作中没有可推荐的二线方案。
世界卫生组织(WHO) 推荐:当一线方案治疗失败后,整个治疗方案的所有药物都要改变(表2) 。为保证治疗的成功以及减少交叉耐药的危险,二线方案使用的药物要对病毒株保持活性,最好所有的3 种药都是新的,其中至少一种是属于新的一类药。
对于二线方案治疗,越简单越好。在治疗的后期,目前提出一个新颖的策略:单独使用NRTI ,使病毒“锁定”在一种特定的、弱化的进程中,这样,我们就有时间期待出现一些新型药物以提供新的抑制病毒的方法。
10 结语
HIV-1 的耐药突变形势严峻,迫切需要耐药性检测进行指导。HIV-1 耐药性基因型检测可有效地检测HIV-1 感染者血浆中耐药性病毒株的存在,对于选择挽救性治疗方案具有很好的临床指导意义。同时,及时了解耐药突变的发生及其临床意义对调整治疗尤为重要。
