鸡卵黄抗体研究进展

作者：张绍兰
作者单位：成都医学院病原生物学教研室，四川 成都 610083
《西南军医》2008年6月10卷3期 综述讲座与进展
【关键词】  鸡；卵黄抗体；研究进展
　　抗体(免疫球蛋白，Ig)是指机体受到外来抗原物质刺激后，B细胞识别抗原后活化、增殖分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的能与相应抗原特异性识别和结合的一类球蛋白。经特定抗原免疫后的母鸡可产生相应的特异性抗体，有研究证实［1］，产蛋鸡的卵黄对抗体有浓集作用，使其不断储存于卵黄中，这种抗体称为卵黄抗体(Immunoglobulin of yolk，IgY)，卵黄抗体是当今生物科学研究领域的一项重大发现。自1893年Klemperer首次报道鸡蛋中存在抗体以来，卵黄抗体的研究不断深入，本文就免疫鸡卵黄抗体的研究进展综述如下。

　　1  IgY的性质和特点

　　1.1  IgY的性质  IgY的性质与哺乳动物的IgG相似。正常鸡IgY的分子量约为180KDa，由两条轻链(2L)和两条重链(2H)组成，分子量分别为60-70KDa和22-30KDa。其等电点约为5.2。随着研究的深入，更多的以为IgY可能是哺乳动物的IgG和IgE的祖先［2］。IgG和IgY在结构上有较多差异，IgY的重链有1个可变区，4个稳定区(Cv1-Cv4)，无铰链区，而哺乳动物IgG只有3个稳定区(Cγ1-Cγ3)。最近研究表明［3］，IgY的疏水基团多于IgG，比较IgG和IgY的C-端序列发现，IgG的Cγ2和Cγ3区与IgY的Cv3和Cv4区十分相似。

　　1.2  IgY的特点  由于禽类与哺乳动物生物系统发育的差距，两者的亲缘关系较疏远，哺乳动物的蛋白质抗原在禽体内更易产生特异性较高的抗体，所以IgY的生化特性优于哺乳动物抗体［4］。许多研究表明［3，5］，IgY不能活化哺乳动物的补体系统，不与血清中存在的类风湿因子(RF)起反应，不与蛋白质A和G起反应，不影响哺乳动物IgG发挥作用，且不与哺乳动物的Fc受体起反应。因此IgY可以逃逸干扰，在免疫检测可以避免假阳性反应的发生，有利于实验室诊断和研究，如ELISA、免疫电泳等实验。

　　与哺乳动物IgG相比，IgY具有较强的耐热、耐酸、抗离子强度和一定的抗酶降解能力。经1:20稀释的IgY与1mol/L HCL作用30min后活性降低到1:2，作用60min活性才完全消失。IgY制剂于4℃贮存5年或室温下放置6个月，抗体活性几乎不受影响［6］；IgY溶解于生理盐水中在4℃贮存6～7年，抗体活性降低不超过5％。在通常情况下，IgY基本能耐受巴氏消毒，37℃下其活性基本无明显改变。此外有研究表明［7，8］IgY还具有耐高渗的性能 (在60％的高浓度蔗糖溶液中仍有活性) 和很好的耐反复冻融的特性。IgY对胃蛋白酶有较高的抵抗力，但对胰蛋白酶十分敏感。将胃蛋白酶和IgY在pH２.0温育1h后，几乎所有活性丧失，但在pH4.0 lh后可保持91％的活性,甚至温育10h后仍有63％活性。IgY分别与胰蛋白酶和胰凝乳酶温育8h,活性分别保持39％和41%。因此，口服的卵黄抗体制品能通过消化道，在到达肠道时仍能保持足够的活力以抑制病原菌的侵袭。

　　2  IgY的制备

　　2.1  母鸡的免疫

　　2.1.1  实验动物的选择  一般来说，用于生产卵黄抗体的鸡最好选用近交系的蛋鸡。根据生产IgY的不同目的选择合适的鸡群，如用于治疗目的的IgY的生产应选用SPF鸡，而用于预防目的的IgY的生产可以选用商用蛋鸡。使用SPF鸡的优点是可产生高滴度抗体，而使用商品蛋鸡既价格低廉，又可在产蛋前用来制备抗体而不影响产蛋，因此可以减少制备卵黄抗体的成本。

　　2.1.2  免疫程序  抗原注射途径可选用皮下、皮内、肌肉、静脉、腹股沟、法氏囊注射或通过口服等，也可将多种免疫方法综合使用。通常使用油乳类佐剂如弗氏不完全佐剂(FIA)可以产生明显的抗体反应。在抗原剂量选择上，应将不同浓度的抗原和佐剂结合后进行测试。通常免疫的鸡至少7周龄，最好分两个部位注射，剂量为0.5-1ml。至少要免疫两次，免疫间隔为4～6周，最后一次免疫后第14天测卵黄抗体滴度，如果抗体滴度过低，则应考虑再次免疫。

　　2.2  IgY的分离、提取与纯化  分离主要是除去卵黄中高含量的脂肪及脂蛋白，以获得水溶性组分(Water Soluble Fraction，WSF)。卵黄中的主要成分是蛋白质和脂肪，其比例约为1:2。大部分蛋白质是脂蛋白，存在于卵黄颗粒中，不溶于水，只有卵黄球蛋白是水溶性的，IgY是一种γ-卵黄球蛋白。因此如何去除高浓度的脂类是IgY提纯的关键。
   
　　IgY分离纯化的原则是简便、高效、经济。目前常用的分离方法主要有：有机物沉淀法、有剂溶剂沉淀法、水稀释法(WD法)、超临界气体提取法(SFE法)、去污剂分离法等。为了将IgY从水溶液中分离出来，主要通过超滤法或沉淀法来完成。沉淀法所用的沉淀剂可以是无机物、有机物或有机溶剂，也可以采用多种方法联合沉淀，或二者相相结合来完成。为了满足不同使用目的，需对提取得到的卵黄抗体进一步纯化，除去其中的杂蛋白、盐、沉淀剂及其他杂质，获得高纯度的IgY。目前主要采用层析方法。常用是凝胶层析和离子交换层析。目前使用的提取、纯化方法各有优缺点：沉淀法简单、经济，但其提取的物质纯度低；亲和层析能得到高纯度的特异性卵黄抗体，但因产率低、费用高而不能得到大规模应用，仅适用于科研；WD法和SFE法具有工艺简便、生产成本较低、产品纯度和回收率高等优点，比较适合大规模工业化生产［9］。总的来说，在实际生产过程中，应优化组合各种分离纯化方法，最大限度的做到经济、简便而且产率高。

　　3  IgY的应用
    　　
　　卵黄抗体作为一种廉价、易获得的抗体， 目前已得到越来越广泛的应用。卵黄抗体的应用主要集中于两个方面：纯化后作为诊断试剂和用于疾病的防治。

　　3.1  疾病的诊断  如前所述，卵黄抗体较哺乳动物抗体具有明显的优势，同时避免动物采血的痛苦，提高了动物福利，受到动物保护者的欢迎，因而越来越多的人倡议用卵黄抗体取代高免血清，将来会有更多的IgY被用于制备免疫学诊断试剂。目前国外关于此方面的报道较多，而国内相对较少。据报道卵黄抗体已在琼脂扩散试验、乳胶凝集试验、荧光免疫试验、ELISA等免疫学试验中应用于检测细菌、病毒、寄生虫、酶、激素、免疫球蛋白、受体、红细胞抗原等。王成祖等［10］制备了鸡抗日本血吸虫SEA的特异性高免IgY，实验表明IgY检测具有较高的敏感性，在日本血吸虫病的免疫诊断方面有广阔的应用前景。

　　3.2  疾病的防治  IgY可能主要通过以下作用环节达到抗菌的作用：特定病原菌的卵黄抗体能直接黏附于病原菌的细胞壁上，改变病原细胞的完整性，直接抑制病原菌的生长；卵黄抗体可黏附于细菌的菌毛上，使之不能黏附于肠道黏膜上皮细胞；一部分卵黄抗体在肠道消化酶作用下，降解为可结合片段，这些片段含有抗体的可变小肽(Fab)部分，这些小肽很容易被肠道吸收，进入血液后能与特定的病原菌黏附因子结合，使病原菌不能黏附易感细胞而失去致病性，而IgY的稳定区(Fc部分)留在肠内。Yokoyama等［11］研究发现，产肠毒素型大肠杆菌的IgY可预防断奶仔猪和犊牛因产肠毒素型大肠杆菌引起的腹泻，从而对幼畜起到被动免疫的作用。王忠泽等［12］制备了抗大肠杆菌O157:H7鸡IgY，实验表明其对乳鼠感染模型有明显的保护作用，是一种有潜力的治疗肠道感染的药物。高云英等［13］制备了鸡抗猪大肠杆菌高免IgY，经预防、攻毒试验及临床治疗观察，发现其对仔猪免疫保护率可达90％以上，攻毒保护率98％以上，临床治愈率95％ 以上。ELISA试验表明鸡抗沙门氏菌或抗鼠沙门氏菌IgY具有很高的特异活性［14］。用免疫荧光技术和免疫电镜技术对IgY的特异结合活性作进一步的研究，发现沙门氏菌特异性IgY能结合到沙门氏菌表面的抗原上，并导致细菌表面结构改变。Nikoo等［15］研究证实抗鳗弧菌IgY可以通过腹腔注射、口服和在饲料中添加等方式来提高虹鳟鱼的抗病力。轮状病毒是婴儿和幼龄动物腹泻的病原之一，抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)卵黄抗体(PEDV-IgY)，可防止猪流行性腹泻的流行［16］。穆海菠等［17］从高免卵黄抗体中分离提纯的特异性新城疫抗体，具有明显的中和病毒的作用，特异性较高，而使用纯化后的高免IgY安全、高效、无任何不良反应。目前，新城疫和法氏囊IgY的应用已被广为接受，而且可与多种病原同时免疫鸡体，制成多价IgY用于紧急预防和治疗多种疾病。此外，随着某些抗生素在欧洲被禁用，抗生素替代品的研究日益受到重视，对IgY的研究尤显重要。

　　4  结语
    　
　　鸡卵黄免疫球蛋白作为抗体家族的重要成员，是一种高产、优质的多克隆抗体，具有来源丰富、易于获得、使用方便、成本低廉等特点，较哺乳动物抗体有独特优势，因而具有广阔的开发前景。然而目前卵黄抗体在制备、提纯和使用过程中缺乏统一的标准和成熟的方法，在实际应用过程中对卵黄抗体的使用也常停留在利用粗制品对相应病原进行防治，这些均严重阻碍卵黄抗体的开发和利用。因此，卵黄抗体的应用还需进一步的科学论证和深入研究。

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