早期胰腺癌的基因诊断研究进展

 关键词：胰腺癌      基因诊断 
  
 
    （本文作者：上海浦东新区卫生学校 景湲）

    近年来，胰腺癌的发病率和死亡率呈逐渐上升趋势，每年有新发病例约20 万人，占全部恶性肿瘤发病的2%。其发病隐匿，早期缺乏特异表现，恶性程度高，极易出现转移，80%～90%的胰腺癌病人就诊时，已经到了晚期，手术切除率只有15%，5年生存率为1%～5%。而早期胰腺癌的手术切除率为90%～100%，5 年生存率可达70%～100%。另有研究表明，肿瘤的大小是重要的生存率预测因子，如果直径<1cm，术后5 年生存率接近100%；肿瘤≤2cm，5 年生存率为20%～30%；肿瘤≥3cm，5 年生存率为0%。因此，早期诊断和治疗胰腺癌可以显著提高病人生存率，明显改善预后。现有的诊断方法如B 超、CT、逆行胰胆管造影（ERCP）的早期诊断率低，难以区分良、恶性病变。近年来，基因诊断是肿瘤研究的热点，在对胰腺癌的基因研究中发现其存在基因的改变，提示检测基因的改变可能成为诊断早期胰腺癌的有效方法。笔者就胰腺癌的基因异常，如K-ras 基因突变、端粒酶活性、粘蛋白及DNA 超甲基化的研究现状及其在诊断胰腺癌领域的应用作一综述。

    1 K-ras 基因突变
    K-ras 基因位于染色体12p12，大约4 500 个bp 编码一个2.0kb 的转录物，p21-ras 蛋白位于质膜上并且能够在细胞中转导生长与分化的信号。胰腺癌组织的K-ras 基因能被特异性的点突变所激活，而在慢性胰腺炎标本中却没有发现这一特点。目前，在血浆、胰液标本、细针穿刺的抽取物、粪便标本中进行尝试检测这种基因的变化。
    1.1 K-ras 基因突变和胰腺癌筛选实验
    慢性胰腺炎是胰腺癌的高危因素之一。据报道，在胰液和十二指肠液中检测K-ras 基因突变可以用来筛选胰液标本。Boadas 等收集了50 份胰液样本，包括49 例慢性胰腺炎病人和1 例有慢性胰腺炎家族史病人的样本，结果在8 份基因中检测到K-ras 基因突变，占16%，其中的1 例发展为胰腺癌。另外一个临床应用是筛选粪便样本。Caldas 等收集了胰腺癌、胆管癌和慢性胰腺炎病人的粪便样本进行K-ras 基因突变试验，在胰腺癌中K-ras 基因突变的频率大约在40%~50%，据推测这种突变来源于胰腺癌组织脱落的细胞。K-ras 基因突变作为胰腺癌的筛选工具其特异性和敏感性并不是很高，因此，目前临床应用还受到限制。慢性胰腺炎中K-ras 基因突变的意义仍然存在争议，Queneau 等检测了36 例慢性胰腺炎病人的纯胰液，2例病人阳性，并且分别在检出K-ras 基因突变7 个月和17 个月后被诊断为晚期胰腺癌。在慢性炎症的胰腺导管上皮的良性黏液细胞增生中也发现有63%~71%的K-ras 基因突变，但是仅有大约1%的病人发展为胰腺癌。因此，目前并不推荐K-ras基因用于诊断早期胰腺癌。
    1．2 细针穿刺（FNA）和K-ras 基因
    K-ras 基因突变与细胞分析联合可能是诊断胰腺癌的一个有用工具。对于可疑病例，K-ras 基因突变可以帮助诊断胰腺癌。Urgell 等收集了84 例慢性胰腺炎病人FNA 的样本，同时进行细胞学和K-ras 突变检测，结果诊断60 例为胰腺癌，2 例为粘蛋白囊状肿瘤，4 例为内分泌肿瘤，6 例为其他恶性肿瘤，10 例为慢性胰腺炎，1 例为急性胰腺炎，1 例为结核。随后的细胞学对其中的63 例进行了明确诊断，占75%；非确定性报道21例，占25%。Urban 等也作了相似研究，敏感率92%，特异性100%。K-ras 基因的点突变仅仅表明可能处于癌的早期阶段，因此在慢性胰腺炎中K-ras 基因点突变似乎并不能对其恶性转化进行预测，但是可以作为细胞学检查的辅助方法。即如果一些病人存在胰腺癌的高危因素可以尽早进行外科干预。为了提高早期诊断率并避免对慢性胰腺炎病人进行不必要的胰十二指肠切除，仍然需要对K-ras 基因点突变进行进一步研究，以确定其用于诊断胰腺癌的价值。

    2 端粒酶活性
    端粒酶是由RNA 和蛋白质组成的核糖核酸蛋白酶，是一种RNA 依赖的DNA 聚合酶。自身携带模板是端粒酶区别于一般的纯蛋白逆转录DNA 聚合酶的主要特征。被激活的端粒酶以端粒3′端为引物，以其RNA 组为模板，合成端粒重复序列，以维持端粒长度。激活端粒酶，可以使细胞获得永生性转化，发展成为具有无限增殖力的肿瘤细胞。
    1996 年，首次报道在外科手术中切除的胰腺癌组织中具有很高的端粒酶活性。80%的胰腺癌组织中可以检测到清晰的染色体梯带，在胰腺腺瘤和胰腺炎组织中却没有发现。把端粒酶活性定量化，可以发现相关的端粒酶在癌组织中的活性比在胰腺腺瘤和胰腺炎组织中高出许多。Hiyama 等和Tsutsumi 等分别在95%和84%的胰腺癌组织中检测到端粒酶活性，但在胰腺良性肿瘤中却没有发现。胰腺癌病人的胰液也可以检测到端粒酶活性升高，在24 例胰腺癌病人的胰液标本中，发现83%端粒酶活性增高，但是在23 例胰腺腺瘤的病人中仅测到1 例，占4%。胰液中发现端粒酶活性对诊断由局部胰腺炎引起的主胰管良性狭窄也是有帮助的。由局部胰腺炎引起的严重主胰管狭窄有常规呈像并不能排除胰腺癌，但是检测胰液端粒酶活性可以帮助鉴别诊断病变的良、恶性。因此，检测端粒酶活性可能成为用来鉴别诊断胰腺癌和胰腺腺瘤及慢性胰腺炎的特异性标志。

    3 粘蛋白（MUCs）
    粘蛋白（MUCs）是一个高分子量的糖蛋白家族，在不同恶性肿瘤中有不同的变体。临床上检测肿瘤标志物最常使用的方法是对血液样本基于血清的相关抗原和糖蛋白进行免疫测定，如CA19-9、DUPAN2、CA50、CA125 和最近的CA242。在胰腺癌中CA19-9 血清实验的敏感度在69%~93%之间，特异性在46%~98%之间。但是CA19-9 抗原的增高在慢性胰腺炎和其他癌症病人中也可发现。例如，抗原CA19-9、CA50、CA125 和CA242在糖基化的高分子量的糖蛋白上包含一个寡糖结构，这些分子被胃肠道、呼吸道和泌尿生殖道的上皮细胞广泛合成和表达。到目前为止，粘蛋白基因已被识别的有8 个，包括MUC1-4、MUC5B、MUC5AC、MUC6 和MUC7。但是它们的特征还不清楚。最近，部分的MUC1 和MUC12cDNA 序列也已发表，MUC16 是最新的MUC 蛋白家族的成员之一，它具有部分cDNA 序列的特征，这个序列可以编码CA125。在正常情况下，粘蛋白家族扮演着上皮组织的防护角色，在上皮细胞的更新和分化、细胞黏附的调节以及细胞信号转导中也具有重要作用。
    许多研究分析了胰腺在正常和病理状况下的粘蛋白表达形式，显示MUC1 和MUC6 在正常成人胰腺组织中表达。最近发表的RT-PCR 和RNA 印迹的数据支持这个结果，同时发现在正常胰腺组织中缺乏MUC2、MUC3A、MUC4 和MUC7 的mRNA。通过原位杂交检测到正常胰腺组织和正常导管细胞中含有MUC5B 的mRNA。通过高度敏感的RT-PCR 和窄缝式点杂交法在正常胰腺组织中发现MUC5AC 的mRNA。在原位杂交和免疫组织化学中使用RNA 印迹法并没有显示在正常胰腺导管细胞中存在MUC5AC。但是正常的胰腺导管细胞表达了大部分的MUC1 和MUC6。通常，MUC1 是膜屏障的粘蛋白成员之一，而MUC6 是一个分泌的凝胶形成的粘蛋白。MUC6 作为粘蛋白家族的成员之一，包括MUC2、MUC5AC 和MUC5B，它位于染色体11p15 的部位。除此之外，没有MUC2、MUC4 或MUC7 的表达在正常胰腺组织中被检测到的报道。粘蛋白表达和结构的变化在肿瘤发生和肿瘤损伤都有报道，粘蛋白和他们的血型抗原可帮助诊断恶性肿瘤。从这一点说明粘蛋白家族有可能成为诊断早期胰腺癌的标志物，并可对胰腺良、恶性病变进行鉴别诊断。

    4 DNA 超甲基化
    发展分子标志物对早期肿瘤进行诊断的策略使得临床结果得到改善。在此方面变体的DNA 超甲基化可能成为一个新的诊断和筛选胰腺癌的标志物，尤其对于具有高危因素的病人，如有胰腺癌家族史的病人。DNA 超甲基化的诊断潜力在临床标本中已经被评估，这些标本是从患有不同胰腺疾病的病人中得到的胰液。使用甲基特异的PCR 测定法，Fukushima首先检测到ppENK 和p16 的甲基化，在45 份胰液样本中，30例阳性，占67%。胰液是在外科手术时从患有胰腺癌的病人身上获得，在20 例良性胰腺疾病的胰液里没有检测到甲基化。通过微阵列方法鉴定出3 种基因经常的甲基化（NPTX2、SARP2、,和CLDN5）。在24 例患有胰腺癌病人的胰液中检测到18 份有甲基化的变体，占75%，在良性病人中没有发现这一变体。Yan 等最近使用实时定量MSP（QMSP）证明在42 份胰腺癌胰液的样本中，26 份有高水平p16 启动子的甲基化；对照组是患有良性胆道疾病的病人，24 份有3 份发现，占13%；慢性胰腺炎26 份有2份发现，占8%。但应该说明的是，许多在胰腺癌中经历着甲基化的基因包括ppENK 和p16，在没有新生物的十二指肠也有很低的水平，因此这样的甲基化在患有或未患有胰腺癌病人的十二指肠液中都能检测到。因此，使用变体甲基化检测胰腺癌的策略应该依赖选择胰腺插管的病人，而不是通过十二指肠腔收集到的胰液。从对危险率估计的角度来看，胰腺癌病人比十二指肠新生物更有甲基化的倾向，尤其在固定的CpG 位点上。这个发现使得评估十二指肠的新生物组织是否具有发展为胰腺癌的倾向成为可能。
    治愈胰腺癌的最好机会是当癌症还处于早期就进行治疗。但由于目前缺乏敏感、安全、经济的筛选方法，在普通人群中发现早期胰腺癌还非常困难。尽管对胰腺癌病人的血清和基因标志物研究很多,但目前尚未有一个具有高度敏感性、特异性和准确性的标志物。随着分子生物学与细胞学的发展，应继续加强胰腺癌的基因研究，尽早发现胰腺癌的前体病变，提高生存率。