骨髓间充质干细胞移植治疗心力衰竭的临床应用研究进展

 关键词：心力衰竭       

 
    （本文作者：泸州医学院附属医院 任凌等）

    各种原因的心肌疾病和导致心脏负担过重的病因均可直接或间接引起心肌细胞变性坏死， 收缩与舒张功能降低，最终导致心力衰竭。而既往的研究表明心肌细胞在出生后立即停止分裂，心肌没有成肌细胞，对于有丝分裂信号作出的反应是肥大而非增殖, 意味着心肌细胞一旦出现坏死变性后无再生的能力。虽然最近的研究表明有少量数目的心肌细胞在心肌梗死后表现出分裂增殖的能力，但对于心肌梗死死亡的心肌细胞数目而言，这些分裂增殖的细胞是远远不够的。

    心肌变性、坏死后代之以纤维细胞的增生，同时在神经体液因素的作用下发生心室重塑，表现为心室扩大或肥厚，心肌收缩功能下降，顺应性降低，心功能明显降低。并为此形成恶性循环，直至不可逆的终末阶段。大量的研究已经证实,心室重塑是心力衰竭发生的基本机制， 既往对心力衰竭的治疗，除积极治疗原发病，改善心功能等，对于心室重塑的防治主要是使用ACEI、β-受体阻断剂、醛固酮受体拮抗剂等药物，但往往治疗效果差，复发率高，患者生活质量低。心脏移植虽能取代受损心肌，但费用高昂，供体匮乏，难以在临床推广。

    因此，寻找一种有效促使受损心肌组织再生和修复的机制便成为当前研究的热点。

    骨髓间充质干细胞（MSCs）是来源于骨髓的具有多项分化潜能的干细胞，其内在的生物学特性使之成为心肌再生的理想种子细胞，为此人们已做出大量的相关研究并进入临床1 期试验，下文将近期的研究结果综述如下。

    1 MSCs 的生物学特征
    干细胞是一族具有自我复制及自我更新能力的细胞，骨髓中的干细胞分为两群： 一类是造血干细胞（hematopoieticstem cell）， 为循环血液提供前体细胞， 约占骨髓中的99%到99.9%。另一类为非造血干细胞，在培养中表现出增殖和塑料材料的贴壁特征以及生长呈成纤维细胞样表型，过去往往称为集落形成单位成纤维细胞（clony-forming-fibroblasts,CFUS），又称为骨髓基质细胞（bone marrow strom cell ）或者塑料贴壁细胞。近年来统称为骨髓间充质干细胞（mesenchyralstem cells）（MSCs）。
    骨髓间充质干细胞主要来自于人类的髂前上棘，动物的股骨、胫骨以及胸、腰椎骨。取出的骨髓经用淋巴细胞分离液等密度梯度离心后，按适当的密度种植，并给于基本培养基DMEM（低糖﹢10%胎牛血清）。MSCs 能比较容易地贴附到塑料培养瓶上并开始增殖，呈纤维细胞样表型，约12 到16 天后没有贴壁的造血干细胞将死亡从而得到相对纯化的间充质干细胞。MSCs 为一类混合细胞群， 其表面没有特定的标志物，往往享有同血管内皮细胞、上皮细胞以及肌肉细胞相同的表面标志物使鉴别表面标志物的工作变得非常困难，但通常认为那些缺乏CD34、CD45、CD11B 的贴壁细胞代表真正的MSCs，并可以将之用于MSCs 的免疫纯化。多向分化潜能是一项重要的生物学特征， 从1960 年来的多项研究证实MSCs 能在体外分化为骨骼、软骨、脂肪、肌腱细胞，甚至心肌细胞和神经细胞。移植入体内的干细胞能自动到达体内受损的组织，并受到受损组织的微环境的影响分化为特定的细胞达到修复组织的作用，MSCs 的这些生物学特征使之成为细胞移植和组织再生的理想细胞来源。

    2 MSCs 向心肌组织细胞的分化
    日本学者TeradaN[8]报道骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷处理后，可表现出相应的基因并可调整分化为可自主搏动的心肌细胞。显微镜阶段观察提示MSCs 在未经5-氮胞苷处理前呈纤维细胞样表型，如果不经外界的刺激这种表型经过传代也将继续保持，5-氮胞苷处理1 周后， 细胞的外形逐渐改变，约30%的细胞逐渐增大成球形外观或呈棒状，2 周后形成相邻的细胞连接，3 周后形成肌管样结构， 最后1 次5-氮胞苷处理后这种肌管样结构不会停止分化，而其能保持心肌细胞的外形并至少能搏动8 周以上。电镜下提示分化了的细胞肌管有典型的心肌细胞条纹和细胞中心胞核位置的肌小节的苍白染色。其中最为显著的是出现具有分泌功能的心房颗粒，集中出现在近核细胞质，这些研究证实分化了的细胞具有和心肌细胞相类似的超微结构。对分化了的心肌细胞进行电生理研究表明出现了2 种典型的动作电位： 一种类似窦房结动作电位，另一种类似心室肌动作电位。类窦房结动作电位显示了相对较低的膜电位和较慢的动作电位速度。类心室肌动作电位显示出相对较长的平台期，相对较低的膜静息电位和舒张期缓慢的自动除极，在处理的3~4 周后记录到的都是类心室肌电位。
    研究还表明除了上述使用的刺激外，直接的MSCs－心肌细胞接触也能导致类似上述变化。Fukuhara等人的研究表明：将心肌细胞和MSCs 共同培养后，MSCs 同样能分化为心肌细胞表型，表达肌凝蛋白的重链β-肌动蛋白、肌钙蛋白Ⅰ。但是，仅仅将MSCs 培养于类心肌组织的媒介中，分化后的MSCs 仅能表达β-肌动蛋白，证明MSCs 向心肌细胞表型的分化倚赖于心肌微环境中的信号。此外MSCs 还通过特殊的缝隙连接将MSCs 自身和心肌细胞连接起来， 为MSCs 和心肌细胞之间的信息传递提供了良好的基础。研究还表明：MSCs 除能在心肌组织中分化为心肌细胞外， 还能分化为平滑肌细胞／ 血管外膜细胞和血管内皮细胞， 这些细胞在微血管的再生中发挥重要作用。并得到了免疫组化和病理组织学的证实，逐渐增加的毛细血管密度也在受移植心肌组织中观察到。除此之外，移植的MSCs 能分泌多种细胞因子如成纤维细胞生长因子,血管内皮细胞生长因子，干细胞归巢因子等。MSCs 还能分泌特殊的生长因子如FGF－2，一种广泛的有丝分裂蛋白，能促进尚未分化的MSCs 进行分化。从而有效的促进心肌组织的再生。以上这些资料均表明MSCs 能作为移植的理想种子细胞。

    3 动物实验研究
    既往已有大量的实验研究表明在动物模型（羊、猪、猴）移植MSCs 是可行的， 尽管其移植方法不同（直接注射入心肌、经冠状动脉灌注、经静脉途经全身灌注），使用的种子细胞（未纯化的骨髓单核细胞、纯化的骨髓间充质干细胞）和细胞数量也不尽相同。受体的心肌条件也不一样，但大多数研究都认为：在经冠状动脉或者直接向受损心肌组织注入骨髓间充质干细胞后，移植的细胞能存活于心肌组织并在心肌组织微环境中分化，移植的细胞经数周后发现开始表达心肌细胞特有的标记如α-肌动蛋白、肌钙蛋白Ⅰ和丙酮酸激酶。移植的细胞还出现肌小节的肌浆球蛋白重链以及细胞-细胞连接。Dick 等人建立猪的心肌梗死模型后将使用铁荧光离子标记的骨髓间充质干细胞直接注入梗死区域的边缘，2 周后即发现生长良好的标记细胞开始表达心肌细胞特有的肌肉蛋白，与对照组相比较，心肌收缩能力明显得到提高，心室壁的变薄也得到抑制。
     在有效性得到证实的基础上，干细胞移植的安全性同样得到人们的重视，在上述猪心肌梗死模型的实验中，作者报道直接向心肌注射104~108 个干细胞是安全的，并没有发现有免疫和毒性反应。Davani 等人向狗慢性心肌缺血模型心肌中直接注入细胞（1×108 个），在移植的过程中未发现有心律失常，心电监护未发现ST－T 改变及病理性Q 波。所有的动物在术后均未死亡。但Kraitchman 等人的研究却发现在向正常狗经冠状动脉移植入干细胞后，有亚急性微灶心肌梗死发生， 他们认为是因为骨髓间充质干细胞体积过大（18μm~20μm）阻塞微血管所致，但由于缺乏对照组，尚难明确心肌梗死的原因是由于细胞抑或是导管的操作或者其它的原因所至。

    4 临床试验
    干细胞移植的有效性和安全性在动物实验上得到验证以后，进入了一期临床试验，在体外试验的基础上，2001 年德国学者率先将干细胞移植用于临床，他们的研究表明：在对1例心肌梗死患者行PCI 治疗过程中将自体骨髓间充质干细胞移植入相关梗死动脉，10 周后，左室功能得到明显改善，梗死面积明显缩小，心脏指数增加了20%~30%，并证明了该治疗的安全性。2002 年国外进行的TOPCARE -AMI 和BOOST 两项小规模临床试验均证明移植干细胞后患者没有出现恶性的心律失常及其它严重的副作用，且大多数参与研究的学者均认为虽然干细胞移植治疗的机理远远还未阐明，但移植后患者的左室功能得到改善，心功能指标较对照组有明显的提高，有利于防止梗死后心室重构及防止出现潜在的恶性心脏事件。有进一步进行大规模双盲对照实验的必要。
    2004 年中国学者陈绍良将69 名急性心肌梗死的患者随机分组，急诊PCI 开通罪犯血管后3 天，采集自身骨髓，提取骨髓间充质干细胞后体外扩增，2 周后使用OTW 球囊将自体骨髓间充质干细胞经罪犯血管注入心肌组织中，而对照组仅注入生理盐水。干细胞植入前及术后3 个月行门控双核素心肌灌注／ 代谢显像检查，预测存活及坏死心肌，并获取梗死面积。同时行超声心动图检查评价室壁运动、心功能指标，术后3 个月复查上述影像学指标发现治疗组患者梗死面积明显减少，坏死区域心肌血流灌注、代谢改善，术前判定为无存活心肌节段术后明显减少，左室射血分数明显增加，患者心功能得到改善。术后并未发现与细胞直径相关的微灶心肌梗死及其他的严重并发症。葛均波等人对500 例患者的研究表明对ST段抬高的急性心肌梗死患者，亚急性心肌梗死患者，陈旧性心肌梗死患者以及原发性扩张性心肌病患者进行了经冠状动脉自体骨髓单个核细胞移植，随访6 月。结果发现前两组患者心功能改善显著， 但对于发病时间超过6 月的陈旧性心肌梗死患者以及原发性扩张性心肌病患者，移植自体骨髓间充质干细胞后左室收缩功能的改善有限。为进一步验证细胞移植的有效性和安全性，Minguell 等人将欲行冠脉搭桥术的患者随机分组，移植组术前先抽取骨髓提取并体外扩增骨髓间充质干细胞，手术前1 日再次抽取骨髓提取骨髓有核细胞，当搭桥手术完成后，将上述准备的细胞混合注射到梗死区域的边缘，所有的患者术中及术后均未出现严重并发症。术后4 月MRI结果提示与对照组相比较，治疗组患者左室射血分数有显著的增加。并因此认为移植是有效和安全的。

    虽然目前MSCs 移植治疗心衰的研究取得了令人鼓舞的成就，但是距临床广泛应用仍还有一段很长时间，目前还存在很多尚未解决的问题，其分化调控、信号转导、归巢分子机制仍待进一步深入研究。临床试验阶段尚仅进入初始阶段，收集的患者数目过少，细胞采集的方法以及实验结果评判手段多种多样，临床治疗效果也有待于进一步评价，因此，继续深入了解MSCs 移植在心衰治疗中的作用将有助于为临床治疗心衰提供新的思路和方法。