AngⅡ诱导血管内皮细胞衰老相关基因表达的研究

　Study on gene expression associated with senescence of endothelial cell induced by angiotensin Ⅱ

　　SHAN HaiYan, BAI XiaoJuan, ZHANG WeiGuang, et al.

　　Department of Gerontology Cardiology, the First Affiliated Hospital, China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning, China

　　【Abstract】Objective  To explore the senescence of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and p16INK4a, p21cip1 gene expression associated with senescence induced by angiotensin Ⅱ(AngⅡ). Methods  HUVECs were cultured in vitro and intervened by AngⅡ (stimulated with AngⅡ10-6 mol/L for 48 h). The morphological change of cells were observed by optical microscopy. βgal staining and cell cycle analysis were used to identify cell aging status. The positive cell rate of p16INK4a was detected by immunocytochemical staining, and the expressions of p16INK4a, p21cip1 protein were determined by Westernblotting. Results  The cells appeared flattened and enlarged induced by AngⅡ, the positive cell number of βgal staining was significantly higher in AngⅡinduced cells (80.10%±6.81%) than that in control cells. The cell cycle was arrested at G0/G1 (91.36%±6.45%), suggestting cell senescence. AngⅡ upregulated the expression of p16INK4a and p21cip1 protein of HUVECs with time dependency mode. Conclusions  One of vascular endothelial cell senescence molecular mechanisms induced by AngⅡ may be relevant to the upregulated expressions of p16INK4a and p21cip1 protein and the cell cycle arrested at G1, which provide experimental evidence to delaying cell and vascular senescence.
   
　　【Key words】AngiotensinⅡ; Vascular senescence; Cell cycle; p16INK4a; p21cip1

　　内皮细胞生物学改变是人类衰老和疾病的基础〔1〕，内皮细胞功能失调不仅是血管衰老的特征性表现，也有可能是血管衰老的启动和维持因素，因此研究衰老的内皮细胞功能改变的机制是研究血管衰老的基础〔2〕。目前，人们普遍认为衰老相关基因对细胞衰老起主要作用并引起特征性形态改变及衰老性生长停滞，其中p16INK4a及p21cip1是细胞衰老过程中的两个关键产物，被称为衰老相关基因〔3，4〕，其表达量与衰老的表型及衰老进程密切相关，作为检测细胞衰老的分子指标应用于衰老的相关研究。本实验通过血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导血管内皮细胞衰老，动态检测不同时间p16INK4a及p21cip1蛋白表达，为研究血管内皮细胞衰老的分子机制及衰老通路提供理论依据。

1  材料与方法

　　1.1  材料

　　RPMI 1640培养基、胰蛋白酶、HEPES、L谷氨酰胺（Gibco公司），人脐静脉内皮细胞株(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)（ATCC公司），AngⅡ、二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)（BD公司），兔抗人p16INK4a、p21cip1单克隆抗体非免疫血清、生物素二抗（Biotin Conjigatad公司）及辣根酶标记的链酶亲和素（HRPStreptaridin）试剂（Santa Cruz公司），流式细胞仪(BD FACSAria公司)，透射电子显微镜(H600TEM公司)，荧光显微镜（Olympus公司），Biophotometer分光光度仪(Eppendort，德国)；计算机及显微图像分析系统(Meta Morph/DD10/BX51)；UVP凝胶成像及分析系统(UVP公司，英国)。

　　1.2  HUVEC培养和鉴定

　　将HUVECs贴壁生长于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，在5%CO2、37℃和完全饱和湿度的培养箱中培养，2～3 d换液以维持良好生长状态。用0.25%胰蛋白酶进行消化﹑传代。内皮细胞呈多角形，单层铺路石状紧密排列。2%台盼蓝染色判断细胞活性，活细胞数占细胞总数的98%以上用于实验。

　　1.3  HUVEC衰老模型建立

　　细胞长至亚融合后，无血清同步6 h，加入AngⅡ终浓度为10-6mol/L，持续刺激48 h，第12、24小时各补充AngⅡ1次即为AngⅡ诱导的HUVECs衰老模型，见参考文献〔5，6〕。对照组为不含AngⅡ上述培养液培养48 h。

　　1.4  β半乳糖苷酶（βgal）染色

　　依据Serrano和Dimri〔5，6〕提出经典衰老细胞的鉴定方法，用PBS（pH7.2）洗单层细胞1次，再以PBS（pH7.2）配置的0.5%戊二醛溶液固定5 min,然后用PBS（pH7.2,含1 mmol/L MgCl2）洗1次；在新鲜配置的Xgal 染液(1 g/L Xgal于PBS，0.12 mmol/L K3Fe〔CN〕6，0.12 mmol/L K4Fe〔CN〕6，1 mmol/L MgCl2，pH6.0）中染色,37℃孵育12～16 h。

　　1.5  流式细胞术分析细胞周期

　　用0.25%胰蛋白酶消化细胞，约收集1×106个细胞,1 000 r/min离心，细胞用PBS洗2次后悬浮于500 μl PBS中，充分吹散混匀，缓慢加入5 ml冷乙醇，4℃固定过夜。离心弃去乙醇，细胞用冷PBS洗2次后悬浮于0.5 ml PBS中。加入500 μl的碘化丙啶(终浓度50 μg/ml)，4℃避光反应30 min。流式分析（激发光波长488 nm，发射光波长570 nm），细胞流速不超过60个/min；数据用BD公司提供的Moldifit2.0分析。

　　1.6  p16INK4a免疫细胞化学染色检测

　　将严格清洗、浸酸、消毒的洁净盖玻片放置于6孔培养板中，AngⅡ诱导0、12、24、36、48 h的HUVECs作细胞爬片，PBS洗细胞，采用SP法进行免疫组化染色，DAB显色，常规脱水、透明、封固。在40×10倍的光镜视野下，分别对相邻切片的p16INK4a染色阳性细胞进行统计，显微镜下胞浆或胞核有棕色颗粒者为阳性细胞，计数每个高倍视野中100个细胞中p16INK4a阳性细胞个数，每张切片中采集5个视野，求出均值用x±s表示，得出阳性细胞百分率。

　　1.7  Western印迹法检测p16INK4a、p21cip1蛋白水平 
　　收集AngⅡ诱导0、12、24、36、48 h细胞，用冰冷的PBS洗2次，加入预冷细胞裂解液裂解细胞，超声破碎，提取物冰上孵育30 min，4℃,12 000 r/min离心10 min后上清液至新试管中，再次离心1次，取上清分装，-20℃保存待用。考马斯亮蓝法测定蛋白样品浓度，每个样品上样量为20 μl，按文献报道的Western印迹方法〔13〕，完成常规蛋白电泳分离胶浓度为12%（pH8.8），浓缩胶浓度4%(pH6.8)，抽提纯化的蛋白行SDSPAGE电泳后转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉的TBST 4℃封闭过夜，加入一抗（兔抗人p16INK4a、p21cip1抗体，1∶100）室温摇床孵育3 h，TBST洗涤后，与二抗室温摇床孵育0.5 h，常规洗膜化学发光试剂显色。AlphaImager图像处理系统进行定量分析，设对照组显影带灰度值为1，各不同时间组与其灰度值之比为该组的相对活性。

　1.8  统计学处理

　　采用SPSS 11.5软件包对数据进行统计处理，各项观察指标以x±s表示，计量资料比较采用单因素方差分析。

　　2  结果

　　2.1  细胞的形态学改变

　　用相差显微镜动态观察细胞形态变化：对照组HUVECs生长良好，呈长梭形或不规则形；AngⅡ诱导组HUVECs排列不规则，体积较大，形态扁平，胞浆区域增大，细胞浆/细胞核的比例增加，胞浆中可见较多颗粒或空泡（图1）。

　　2.2  p16INK4a免疫细胞化学染色表达

　　p16INK4a定位于胞浆中，以胞浆出现棕黄色染色为其阳性判定标准。p16INK4a胞浆呈棕黄色为阳性细胞，仅显示细胞轮廓者为阴性细胞。随AngⅡ诱导HUVECs时间延长，p16INK4a阳性细胞百分率明显增高AngⅡ诱导12、24、36、48 h p16INK4a阳性细胞百分率分别为（19.24±2.04）%、（42.86±3.91）%、（67.54±5.78）%、（81.89±7.90）%，与诱导0 h组（3.46±0.21）%比较有统计学意义（P＜0.01）（图2）。

　　2.3  衰老相关的βgal活性

　　βgal活性是鉴定细胞衰老的生物学标志，随着细胞老化，在pH6.0条件下，细胞内增高的βgal降解其底物Xgal后，产生蓝色产物也增多，故可用组织化学染色进行检测。结果约80%的10-6mol/L AngⅡ诱导HUVECs出现蓝色的βgal阳性染色，表明AngⅡ诱导可导致HUVECs的衰老。

　　2.4  细胞周期分析

　　细胞增殖能力下降是衰老的另一个生物学标志，而细胞周期变化可反映细胞的增殖能力。流式细胞仪分析显示AngⅡ诱导组与对照组HUVECs比较，大部分HUVEC停滞于G0/G1期［(91.36±6.45)% vs (53.12±5.83)%,P＜0.01]，S期〔(2.12±0.33)% vs (30.46±3.12)%,P＜0.01〕及G2/M期趋于消失〔(2.12±0.33)% vs (16.32±1.65)%,P＜0.01〕，而对照组HUVECs的各期比例正常。两组间各周期的细胞数也有显著差异，说明AngⅡ诱导细胞生长逐渐停滞，细胞增殖能力明显下降。

　　2.5  p16、p21蛋白表达

　　Western印迹法显示，HUVECs静息时仅表达微量的p16INK4a、p21cip1蛋白，AngⅡ呈时间依赖性地上调p21cip1蛋白表达，AngⅡ诱导HUVECs 12 h，p21cip1蛋白质表达逐渐增高，36 h p21cip1蛋白质表达至高峰(P＜0.01)；虽AngⅡ呈时间依赖性地上调p16INK4a蛋白表达，但AngⅡ诱导HUVECs 24 h，p16INK4a蛋白质表达逐渐增高，48 h p16INK4a蛋白质表达至高峰(P＜0.01)（图3）。

　　3  讨论

    AngⅡ是肾素血管紧张素系统(RAS)中主要的效应肽,通过受体发挥生物学作用,体内外有关实验显示衰老时循环水平RAS活性可能降低,但心肌、血管等组织AngⅡ合成增加，受体密度上调，表现为血管的衰老改变及心血管病危险性增高，提示AngⅡ的作用与衰老可能有关〔7〕。故本研究采用已建立的AngⅡ诱导血管内皮细胞衰老模型〔5，6〕,探讨体外细胞复制衰老过程中细胞周期蛋白p16INK4a、p21cip1在此过程中的可能作用。细胞周期是细胞生命活动中的基本过程，细胞在周期时相的变迁中进入增殖、分化、衰老和死亡等生理状态。细胞周期运转是十分有序的，沿着G1期S期G2期M期的顺序进行，细胞周期具有G1/S与G2/M两个调控点，其中G1/S点是启动细胞周期循环的关键，细胞衰老最显著的特征是细胞在很长一段时间内仍维持代谢活性，但因阻滞于G1期，失去了对有丝分裂原的反应和合成DNA的能力，不能进入S期。已有研究证实，一旦细胞发生衰老，细胞内多种分化和增殖调控基因表达即发生改变，细胞呈现终末分化状态，增殖能力下降，G1细胞周期阻滞发生〔8〕，这与本研究结果相一致。
   
　　p16INK4a蛋白在正常生长细胞中表达水平较低，但在细胞多次复制接近衰老时其表达水平逐渐增高，2004年有学者提出p16INK4a能作为测定细胞衰老的分子标记以区别于单从时间上对衰老的界定〔3〕。p21cip1则是细胞周期依赖激酶（CDK）的非特异性抑制剂，其具有抑制Rb磷酸化，阻遏E2F释放，使细胞周期停留G1/S点不能进入S期的作用。已有大量研究表明，一旦收到来自p16INK4a、p21cip1途径的衰老信号后，p16INK4a、p21cip1蛋白就成为控制衰老过程的中心环节，细胞则进入衰老程序，停止增殖并且发生一系列形态和功能上的变化〔8～10〕。

　本研究观察AngⅡ诱导血管内皮细胞衰老过程中细胞周期蛋白p16INK4a表达的变化，发现衰老细胞的p16INK4a蛋白表达量逐渐增高，提示p16INK4a可能通过抑制CDK46/D激酶的活性，使RB蛋白保持非磷酸化，减少了转录因子E2F的释放，使细胞内不能表达E2F依赖的G1晚期蛋白，使细胞DNA增殖不能通过G1/S调控点，阻滞在G1期〔9〕。但p16INK4a促进衰老作用是否与抑制其负调控元件有关还有待于进一步的研究。

    另外，在本研究AngⅡ诱导0、12、24 h的HUVECs中，p16INK4a蛋白表达量较p21cip1蛋白表达低，可能与已知的p21cip1先于p16INK4a表达有关，即p21cip1先于p16INK4a的增加是相继的，推测p21cip1表达增加出现在大多数细胞丧失增殖潜力时，而p16INK4a的表达增加出现在所有细胞丧失增殖能力时的衰老终末期，提示p21cip1先可能在细胞复制衰老的晚期激活p16INK4a，p21cip1启动细胞衰老机制而p16INK4a维持细胞衰老的进程。

    综上所述，细胞周期蛋白p16INK4a、p21cip1在AngⅡ诱导的HUVECs衰老过程中可能起着重要作用，但具体p16INK4a、p21cip1通路何者起关键作用以及是否两条途径共同起作用有待于进一步研究。同时笔者认为，AngⅡ诱导血管内皮细胞衰老机制的深入研究，将为动脉硬化等内皮衰老相关疾病的诊治提供新的研究思路。