镉对大鼠肾细胞毒性和脂质过氧化作用的影响

摘要:目的　探讨氯化镉对NRK大鼠肾细胞毒性作用和脂质过氧化的影响。　方法　CdCl2 对NRK细胞染毒后,用MTT方法测定细胞的生长抑制,并测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH) 、丙二醛(MDA) 和超氧化物歧化酶(SOD) 含量,观察镉的细胞毒性和对脂质过氧化影响。　结果　MTT 实验显示CdCl2 对NRK细胞的生长抑制作用随染毒浓度增加而增强, 呈明显的剂量—效应关系;CdCl2 染毒后使细胞培养液中LDH、MDA 浓度高于对照组,而SOD 水平低于对照组。　结论　CdCl2对NRK细胞有一定的细胞毒性作用, 并对NRK肾细胞的脂质过氧化有明显影响。

关键词:镉; NRK细胞;细胞毒性;脂质过氧化

Impact of cadmium on cytotoxicity and lipid- peroxidation in NRK rat cells. LIU De - jian , MA Zhong - yuan ,LIANGJing - tang. (Shajing Institute for Disease Control and Prevention of Baoan District , Shenzhen 518104 , Guangdong , P. R. China)Abstract :Objective 　To investigate the effects of cadmium chloride on cytotoxicity and lipid - peroxidation reaction in NRKcells. 　Methods 　Various doses of CdCl2 were added to the culture of NRKcells , then cytotoxicity of CdCl2 was tested with MTT as2say. In addition , the concentrations of lactate dehydrogenase (LDH) , malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD)were determined. 　Results 　CdCl2 had obvious inhibitory effect on the growth of NRKcell , the levels of LDH and MAD in CdCl2 -treated groug were higher than that in control group , but SOD in CdCl2 - treated groug were lower than that in control group , the ef2fects of CdCl2 were dose - dependent. 　Conclusion 　Cadmium showed some cytotoxicity on NRKcells , and it obvious influence thelipid - peroxidation reaction of NRK cells.

Key words :Cadmium; NRK cells ; Cytotoxicity ; Lipid - peroxidation

　镉是常见的重金属污染物之一,可通过呼吸道和消化道进入机体,造成机体多器官系统的损害[1 ,2 ] 。镉对人体健康的主要危害部位是肾脏,损害肾小球和肾小管,导致低分子蛋白尿,尿中β2 微球蛋白和视黄醇结合蛋白排泄增加,严重者引起肾功能衰退,骨骼钙质疏松等许多病理损伤[3 ,4 ] 。上世纪60 年代日本发生的“痛痛病”就是工业污染导致的镉中毒。为进一步了解镉对肾脏毒性的作用机制,本文采用大鼠NRK细胞进行培养,用不同剂量的氯化镉染毒,观察镉对NRK大鼠肾细胞的毒性和对丙二醛(MDA) 与超氧化物歧化酶(SOD) 的脂质过氧化影响。

1 　材料与方法

111 　细胞和试剂　NRK细胞购自上海中科院细胞库;DMEM培养基为GIBCO 产品;小牛血清购自杭州四季青生物材料研究所;噻唑蓝(MTT) 为Amresco 公司进口分装品;氯化镉(CdCl2)为Sigma 产品。

112 　细胞培养及处理　NRK细胞在含有10 %胎牛血清、100U/ml 青霉素和100U/ ml 链霉素的DMEM 培养基中传代培养(37 ℃,5 %CO2) ,待其融合度至70 %～80 %时用CdCl2染毒,染毒剂量分别为0、5、10、20、40μmol/ L ,染毒时间为6h、12h、24h。113 　细胞毒性指标检测　105个细胞置96 孔板培养至融合度为70 %～80 %时,弃去旧培养基,继续培养6h、12h、24h。各剂量组均设无细胞对照,处理方法不变。终止前2h 加入噻唑蓝(5g/ L) 继续培养,加入细胞裂解缓冲液( 50 %DMF ,20 % SDS) 终止反应,全自动酶标仪(λ= 570nm) 读取吸光度OD 值。计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率( %) = (对照组OD 值—染毒组OD 值) / 对照组OD 值X100 %。

114 　LDH测定　NRK细胞经不同浓度CdCl2 染毒24h 后,收集细胞培养液上清,按中生北控生物公司的LDH 试剂盒方法,用日立7080 全自动生化分析仪进行测定。

115 　MDA 和SOD 含量测定　采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒,按照试剂盒的使用说明操作。

2 　结果

211 　细胞形态变化　实验前各组细胞生长良好,形态长梭形,增殖活跃。实验后开始几小时对照组和不同浓度CdCl2 染毒组的细胞生长及附壁良好,但随CdCl2 染毒浓度升高和染毒时间延长,可见NRK细胞体积变小,细胞密度降低。与对照比较,染毒6h 和12h 细胞形态没有明显的变化,但40μmol/ L 组染毒12h 发现有少量细胞漂浮在培养基上,染毒24h 漂浮在培养基上的细胞增多。

212 　CdCl2 对NRK的细胞毒性　见表1～2。

213 　镉对MAD 和SOD 含量的影响　对照组MAD 和SOD 分别为(5117 ±1136) nmol/ ml 和(6518 ±1113) U/ L。经CdCl2 不同剂量染毒后,除2μmol/ L 组外,其余实验组MAD 含量明显高于对照组( P < 0105 或P < 0101) ;同样除2μmol/ L 组外,各实验组SOD含量明显低于对照组( P < 0105 或P < 0101) 。测定结果说明MAD 和SOD 水平与镉染毒剂量表现出明显的剂量- 效应关系。见表3。

表1 　不同染毒时间和不同剂量CdCl2 对NRK细胞生长抑制率的影响

CdCl2

(μmol/ L)

细胞生长抑制率( %)

6h 12h 24h

0 0123 ±0107 0129 ±0115 0136 ±0113

2 0155 ±0112 0174 ±0121Þ 1156 ±0148ÞÞ

5 1186 ±0149ÞÞ 3108 ±0164ÞÞ 4131 ±1127ÞÞ

10 3122 ±1103ÞÞ 6113 ±1152ÞÞ 9163 ±2118ÞÞ

20 6183 ±2114ÞÞ 10126 ±2135ÞÞ 15107 ±2174ÞÞ

40 8172 ±2136ÞÞ 13122 ±3119ÞÞ 23151 ±3182ÞÞ

注:与对照组比较,ÞP < 0105 ,ÞÞP < 0101。

表2 　CdCl2 对NRK细胞培养基中LDH活性的影响

CdCl2

(μmol/ L)

LDH活性(U/ ml)

6h 12h 24h

0 8613 ±1015 8511 ±9183 9116 ±1112

2 9714 ±1311 10712 ±1116 11513 ±1217Þ

5 12512 ±1418Þ 14218 ±1311Þ 16315 ±1916ÞÞ

10 16916 ±2116ÞÞ 18317 ±2115ÞÞ 21014 ±2115ÞÞ

20 19315 ±2211ÞÞ 21311 ±2512ÞÞ 25312 ±2611ÞÞ

40 21117 ±3114ÞÞ 24716 ±2814ÞÞ 28611 ±2713ÞÞ

注:与对照组比较,ÞP < 0105 ,ÞÞP < 0101。

表3 　氯化镉染毒NRK对细胞培养液中MAD 和SOD 的影响

CdCl2 (μmol/ L) MAD(nmol/ ml) SOD(U/ L)

0 5117 ±1136 6518 ±1113

2 6143 ±2157 7015 ±1216

5 8154 ±2146Þ 6112 ±1115Þ

10 11137 ±3168ÞÞ 4319 ±1218ÞÞ

20 17163 ±3172ÞÞ 3217 ±813ÞÞ

40 22116 ±4125ÞÞ 2416 ±517ÞÞ

注:与对照组比较,ÞP < 0105 ,ÞÞP < 0101。

3 　讨论

镉中毒的主要靶器官之一是肾脏,特别是慢性镉中毒时镉主要蓄积在肾脏,对肾脏产生的损害大于其它脏器。关于镉的肾毒性作用机理,有人提出是细胞凋亡引起的,如王文仲等[2 ]采用体内染毒方式, 用流式细胞术和免疫组化法研究CdCl2对小鼠肾细胞凋亡的影响, 结果观察到CdCl2 诱发肾细胞凋亡。有些体外实验表明镉可致猪肾细胞、转化人肾细胞发生凋亡[6 ] 。也有人认为与金属硫蛋白有关[4 ] ,金属硫蛋白(MT) 进入机体的镉随血液到达肝脏,在肝细胞中MT 受镉的诱导合成并释放到血液中,镉- 金属硫蛋白随血液到肾脏,由于分子量小而很容易通过肾小球到达肾小管腔,被肾小管上皮细胞摄取,在溶酶体中降解,镉重新游离并在肾脏中诱导合成。当镉剂量过大,MT的量不足以结合细胞内游离镉时,肾小管上皮细胞即受到损害,导致肾小管重吸收功能障碍,从而出现低分子量蛋白尿[7 ] 。也有一些作者报道,镉对肾脏的毒性与氧自由基和脂质过氧化作用有关[3 ] 。但通过阅读文献发现,大部分实验是用大鼠或小鼠作为研究对象,采用急性染毒观察镉对脂质过氧化影响,一次腹腔注射不同剂量氯化镉几小时后测定肝肾组织镉和MDA 与GSH 含量。本文选择氯化镉对NRK细胞进行染毒,NRK是一种大鼠肾细胞,对于研究镉的肾毒性作用机理具有重要价值。本文结果说明,氯化镉染毒NRK细胞后有一定的细胞毒性作用,染毒浓度越低细胞毒作用越小。此外Cd2Cl2 引起MDA 含量升高,并随CdCl2 染毒剂量增加而增加,对SOD 含量的影响随染毒剂量增加而下降,MAD 和SOD 两项指标与镉染毒剂量表现出明显的剂量- 效应关系,这些结果表明氯化镉对NRK细胞内的脂质过氧化反应有明显作用,可能是引起肾细胞损害的重要原因之一。

参考文献:

[1 ] 刘杰1 镉的毒性和毒理学研究进展[J ]1 中华劳动卫生职业病杂志,1998 ,16 (1) :2～41

[2 ] 王文仲, 徐兆发1 镉对小鼠肾脏细胞凋亡的影响[J ]1 中国工业医学杂志,2004 ,17(1) :4～61

[3 ] 刘爱萍,赵金垣,刘亚宁,等1 氧自由基在急性镉中毒性肾损伤中的作用[J ]1 中华劳动卫生职业病杂志,1998 ,16(1) :22～231

[4 ] 常秀丽,金泰,陈亮,等1 金属硫蛋白基因亚型表达在镉接触中作为生物标志物的研究[J ]1 中华劳动卫生职业病杂志,2006 ,24(1) :12～151

[5 ] Ishido M, Homma ST , Leung PS , et al1 Cadmium- induced DNAfragmen2tation is inhibitable by zinc in porcine kidney LLC2PK1 cells[J ] .Life Sci ,1995 , 56 :351～3561

[6 ] Hamada T , Sasaguri T , Tnimoto A , et al1 Apoptosis of human kidney 293cells is promoted by polymerized cadmium - metallothionein [ J ] 1BiochemBiophys Res Commun , 1996 , 219 :829～8341

[7 ] Klaaseen CD , Liu J1 Metallothionein :an intracellular protein to protect a2gainst cadmium toxicity[J ]1 Annu Rev Pharmacol Toxicol , 1999 ,39 :267～2941