杏仁核脑片场电位的记录及其应用

【摘要】  方针： 探讨基底外侧杏仁核（BLA）离体脑片场电位的记实及其应用. 体例： 制备杏仁核脑片，在脑片上记实场电位,不雅观察其药理学特征并指导杏仁核的永劫程增强（LTP）. 功效： 在脑片连结精巧活性及记实系统噪音幅度小于0.01 mV的前提下，应用国产微电极放年夜器及记实系统即可记实到安定靠得住的杏仁核场电位,巨细约为海马CA1场电位的1/10；在灌流液中加入α氨基羟甲基恶唑丙酸（AMPAR）受体拮抗剂氰基2硝基喹啉2，3二酮（CNQX）10 μmol/L和N甲基D天冬氨酸（NMDAR）受体阻断剂D，L2氨基5磷酸基戊酸(APV)100 μmol/L后，场电位几乎完全被阻断. 应用两串高频刺激（阻遏距离10 min）刺激外囊，在BLA可指导LTP. 结论： 杏仁核脑片可记实到安定靠得住的场电位，适用于研究杏仁核的突触可塑性等功效及探讨杏仁核在神经疾病中的浸染及其机制.

【关头词】  杏仁核；场电位；永劫程增强

     0弁言

    杏仁核与进修记忆、激情、激情慎密亲密相关［1］，而且介入精神割裂症、烦闷、癫痫和创伤后应激障碍等多种神经系统疾病的病理历程［2-3］. 然而杏仁核深藏于年夜脑深部，被巨年夜年夜雅的神经结构包绕［4］，很难直接探测到杏仁核神经元的勾当. 脑片是研究杏仁核功效斗劲理想的标本. 脑片上记实神经细胞的勾当体例主要有膜片钳、传统的细胞内和场电位记实，前两者对仪器设置装备摆设要求较高，而场电位记实对设置装备摆设要求相对大略，并可以反映神经细胞的功效状况，易于推广. 我们接纳国内的设置装备摆设系统，制备杏仁核脑片，在脑片上记实场电位,不雅观察其药理学特征并指导杏仁核的永劫程增强（longterm potentiation，LTP），以探讨杏仁核场电位的记实及其应用.

    1质料和体例

    1.1质料健康SD年夜鼠24只，雄性，体质量200～250 g（福建医科年夜学执行动物中心），全数动物均在12 h光照/漆黑周期情形中饲养，自由摄食及饮水. D，L2氨基5磷酸基戊酸(APV), 氰基2硝基喹啉2，3二酮(CNQX),谷氨酸(美国Sigma公司)；微电极放年夜器,RM 6240数据收罗系统（成都仪器厂），别的化学产品均为国产剖析纯.

    1.2体例

    1.2.1杏仁核脑片制备将SD年夜鼠以氟烷麻醉后断头，火速取脑，放置在低于4℃的冰凉人工脑脊液中并进行修块. 人工脑脊液中各种离子身分及其浓度(mmol/L)为：NaCl 124，KCl 3.0，CaCl2 1.5，MgCl2 1.5，NaH2PO3 1.25，NaHCO3 25,葡萄糖11. 人工脑脊液始终充以950 mL/L O2和50 mL/L CO2，pH7.2～7.4. 用振动切片机把含有杏仁核或海马的年夜脑部门切成脑片（横切面），厚度500 μm. 脑片实施记实前在常温人工脑脊液中孵育至少1 h.

    1.2.2杏仁核脑片场电位记实将脑片移至界面型记实槽(廉价)，经由过程尼龙网与槽内助工脑脊液干戈，以1～2 mL/min连续灌流脑片,脑脊液温度节制在(30±1)℃，用950 mL/L O2和50 mL/L CO2搅浑气体弥散在脑片四周. 在剖解显微镜下将双极不锈钢刺激电极置于外囊，记实微电极置于基底外侧杏仁核(basolateral amygdale, BLA)区，其尖端置于脑片概况下约200 μm处. 刺激电极与记实部位之间的距离约为2 mm. 微电极内充灌3 mol/L NaCl溶液，阻抗为2～5 MΩ. 场电位经微电极放年夜器放年夜后，输出旌旗灯号用数据收罗系统RM6240进行旌旗灯号的记实、剖析和处置. 场电位记实基线安定20 min后才起头下一步的实施. 场电位的斜率用平均根柢值标准化. 通例刺激的单相方波旌旗灯号由RM6240的程控刺激器发生. 刺激方波的波宽为0.1 ms，频率为0.1 Hz，并调整刺激强度使突触反映即是最年夜突触电位的一半. LTP的指导应用两串频率为100 Hz的高频刺激，每勾通续1 s，串阻遏距离为10 min. 记实海马场电位时刺激电极放置于海马（cornu ammonis 1, CA1）区的Schafer侧支通路上，记实电极位于海马CA1区.

    1.2.3药物加入实施历程中应用的药物均加入到灌流脑片的人工脑脊液中.

    统计学处置:接纳SPSS10.0统计剖析软件进行数据录入和清算，实施数据用x±s浮现，组间接纳方差剖析. P<0.05为差别具有统计学意义.

    2功效

    2.1杏仁核与海马场电位的斗劲海马CA1区场电位的幅度为(1.46±0.10) mV（n=10，图1）. BLA的电位为(0.13±0.05) mV（n=9），其放年夜倍数为海马的10倍，杏仁核的场电位只有海马CA1场电位的1/10.

    2.2杏仁核场电位的药理学特征在灌流的人工脑脊液中加入0.1 μmol/L谷氨酸,可见场电位较着增年夜，洗去谷氨酸后场电位根柢恢复至基线的水平(图2A). 灌流液中加入α氨基羟甲基恶唑丙酸(AMPA)受体拮抗剂CNQX 10 μmol后，场电位的幅度较着下降，进一步加入N甲基D天冬氨酸(NMDA)受体阻断剂APV100 μmol后，场电位几乎消逝,洗去CNQX和APV后，场电位根柢恢复至加药前的水平(图 2B).

    2.3杏仁核LTP的诱导在场电位记实安定10 min后，阻遏距离10 min应用两串高频刺激外囊，同时不雅观察场电位幅度和斜率的转变情形. BLA场电位的幅度和斜率的转变趋向齐截(表1)，两串高频刺激后，场电位较着增年夜，之后场电位渐渐下降，高频刺激15 min后场电位根柢安定，但仍较着年夜于根柢值（n=9, P<0.01）,这种增强浸染连续30 min以上. 经由过程对场电位斜率用根柢值标准化后，可见两串高频刺激后30 min增强的场电位的斜率模拟仍是维持在根柢值的(146.1±6.9)％(n=9, P<0.01，图3).表1两串高频刺激前后场电位幅度和斜率的转变

    3谈判

    杏仁核又称杏仁复合体，是年夜年夜都哺乳类动物共有的结构，位于颞叶内. 杏仁核可分为良多巨细不等的核团，凡是将这些核群分为皮质内侧群、基底外侧核群和前杏仁区、皮质杏仁移行区两年夜过渡区［4］. 杏仁核与皮层和皮层下结构有着普遍的纤维联系，跟着神经科学的发展，杏仁核的功效倍受关注［5］. 然而因为剖解结构的关连，很难经由过程电心理的本事直接记实到在体动物杏仁核的神经细胞的勾当，而且在体实施易受到血压、呼吸和血脑屏障等的影响. 脑片标本具有有序的神经元和纤维排列及斗劲完整的神经剖解通路，可在剖解显微镜下直接定位，便于电心理操纵，脑片能够复制出集体动物年夜年夜都电心理现象，模拟在体实施，因而脑片是研究杏仁核功效的斗劲理想的标本.

    脑片上应用场电位记实的体例研究神经细胞的勾昔时夜都是在海马上进行［6］. 有研究［7］报道，经由过程记实杏仁核的场电位研究杏仁核功效，然而这类研究都是在国外的研究室开展，而且实施仪器都是国外生产，价钱昂贵. 我们应用国产SWF2W微电极放年夜器和RM6240记实系统，价钱廉价，而且可以安定地记实到杏仁核的场电位. 杏仁核的神经细胞漫衍较奇异，场电位小，年夜约只有海马的1/10，实施中要求旌旗灯号的放年夜倍数为记实海马CA1的10倍. 因为信噪比小，是以记实安定的杏仁核场电位难度极年夜. 在脑片连结精巧活性的前提下，记实系统要求抗干扰强，噪音的幅度应小于0.01 mV. 记实系统具有精巧的屏障和接地后，若是还有斗劲年夜的50 Hz的噪音，可操纵噪音消弭器去除该频率的干扰，但又不影响旌旗灯号自己的提取. 在脑片连结精巧活性及记实系统具有很强的抗干扰浸染的情形下，只要旌旗灯号放年夜到必定水平，就可以在杏仁核记实加入电位.

    在杏仁核的脑片上，刺激外囊可以在BLA记实到突触后反映，来自皮层的神经纤维经外囊投射至BLA，刺激外囊可模拟皮层的欢快输入［8］. 由皮层投射到BLA的纤维重若是谷氨酸能神经元，BLA记实到的重若是欢快性的突触后电位. 在灌流液中加入谷氨酸，场电位较着增年夜；加入AMPA受体阻断剂CNQX后，场电位的幅度较着降低，进一步加入NMDA受体拮抗剂APV后，场电位几乎完全被阻断，洗去阻断剂后场电位根柢恢复，提醒外囊至BLA的突触联系主要以谷氨酸为神经递质，由AMPA受体和NMDA受体介导，曩昔者为主. 也提醒在灌流液中加入药物，经由过程不雅观察药物对场电位的浸染探讨药物对杏仁核功效的影响.

    脑片场电位常用于研究海马的突触可塑性如LTP和LTD，LTP和LTD被觉得是进修记忆的根柢机制［9］. 研究批注杏仁核介入感激情情相关的进修与记忆历程，提醒杏仁核的场电位有概略诱导出LTP. 功效批注，我们的实施系统在杏仁核可以诱导出LTP,实施中相隔10 min予以外囊高频刺激，不雅观察到记实的BLA场电位的幅度和斜率均较着增年夜，而且连续时刻在30 min以上. 杏仁核的LTP概略介入了进修与记忆的历程，杏仁核的场电位记实有助于研究杏仁核的突触可塑性.

    综上所述，在杏仁核脑片上建树安定的场电位记实体例，有利于研究杏仁核的功效、不雅观察药物对杏仁核的浸染以及探讨杏仁核在精神疾病中的浸染及其机制.

    统计学处置：接纳SPSS13.0软件进行统计学剖析，弃世亡率接纳Chisquare磨练或Fisher切确概率法剖析，犬血气，肺含水量、肺总卵白量、肺还原型谷胱苷肽含量的组间均数斗劲接纳方差剖析，多个样本均数间的多重斗劲接纳LSDt磨练，方差不齐时以及肺光镜搜检提醒的损伤品级行非参Kruskal Wallis H 磨练. P<0.05为差别具有统计学意义.

    2功效

    2.1各组打击波致伤压力A组犬距爆炸源1 m，B组犬距爆源1 m，C组犬距爆炸源0.8 m，在胸骨处超压分袂为54，107，210 mmHg，多个压力传感器均未丈量到反射波超压，仅在距爆炸源2.6 m处丈量到最年夜反射波压力16 mmHg.

    2.2弃世亡率弃世亡率随火药计量增添而增添，A组全数存活；B组现场弃世亡2只，弃世亡率为33.3％；C组现场弃世亡4只，6 h活杀1只，弃世亡率为80％. 组间弃世亡率差别具有统计学意义（P<0.05）.

    2.3病理心理转变爆炸后1 min至弃世亡或处弃世前全数致伤犬心律不齐，心率主要波动40～70次/min，偶高至100次/min以上，爆炸后1 min犬各项根柢生命体征指标见表1.

    各爆炸后致伤犬血压在上述血压值四周波动，至伤后30 min略有回升. 至伤后6 h时，除C组外，全数存活犬血压，呼吸与致伤前无较着差别；C组犬80％弃世亡，剩余存活犬血压（42/18 mmHg）较着低于爆炸前,但略高于爆炸后5 min血压. 伤后30 min，A组致伤犬呼吸频率起头降低，B组犬呼吸频率起头增添，但均和致伤前存在较着差别. 爆炸后2 min，A组犬血气未出现较着转变，B组，C组犬血气转变较着，爆炸前全数犬动脉血气及伤后1 h各组犬动脉血气转变见表2. 爆炸后6 h，血气与爆炸前A组无较着转变，B组转变水平小于爆炸后1 h（P<0.05），C组仅1只犬存活. 各组间犬肺含水量、总卵白含量、谷胱苷肽含量见表3.表1爆炸后1 min各组犬根柢生命体征转变表2爆炸前及爆炸后1 h各组犬血气值(x±s)组别表3肺生化指标转变

    A组犬肺概略标本可见点状出血，B组犬肺出血点增多，66.7％的犬肺部出现片状出血，C组全数犬出现较年夜片状出血. 肺门处机关HE染色镜下不雅察算作果浮现，可见部门肺机关实变（肺泡及间质布满白细胞和红细胞）别的肺泡腔融合或代偿性扩张，呈气肿样转变，部门肺泡细胞脱落，毛细血管扩张严重. 全数犬肺机关镜下未见较着粉红色肺水肿样转变（图1）. 电镜不雅观察浮现，Ⅱ型肺泡上皮细胞脱落，板层体结构消逝，Ⅰ型上皮细胞局灶性坏弃世. A组出血较着轻于B组和C组（P<0.01），B组和C组出血水平无较着差别.

    A: A组犬肺机关HE ×100; B: B组犬肺机关HE ×100; C: C组犬肺机关HE ×100; D: 正常犬肺机关HE ×40.

    图1各组犬光镜照片

    3谈判

    3.1密闭空间内爆震伤动物模子的建树有研究［4-6］批注，操纵打击波复合枪弹发射破片建树胸部爆炸伤模子，小型爆炸源近距离致伤，操纵榴弹和高能战斗部致伤并不雅观察绵羊胸部损伤情形，但这些研究均在开放空间实施. 经由一再试探，本实施操纵爆轰塔乐成模拟室内爆炸，与文献［7-8］报道实施模子对比本实施具有以下利益：① 动物地址位置均放置PCB 137型自由场压力传感器，切确丈量执行动物所蒙受的爆炸压力，爆炸安定、一再性好；② 爆炸距离较远，有用地禁止了爆炸发生的火球对动物造成其他爆炸外的损伤；③ 爆炸源置于1 m高处，不单正对动物胸部，使肺为最直担任伤的脏器，同时使实测爆炸压力值更接近盘算理论值；④ 年夜型动物，年夜当量爆炸源比现有小型动物，小当量爆炸源（<1 g）模子更好地模拟了人爆炸伤；⑤ 有报道指出一再的弱打击波会降低肺损伤阈值［9］，本实施能为室内爆炸打击波一直反射是否加重肺损伤供给最直接的谜底. 研究中A组无弃世亡，损伤较轻，不能反映胸部爆震伤后机体病理心理转变，其爆炸功效提醒，爆炸前犬处于麻醉状况，爆炸时巨年夜的声响和超压波对麻醉状况的犬是一种刺激，爆炸时发生的超压波当然使犬受伤，但犬各脏器尚可代偿，甚至各项指标未出现较着转变甚至PaO2和SaO2还略高于爆炸前，这应归功于犬的应激反映. C组弃世亡率高至80％，弃世亡率高，救治坚苦，损失踪资料过多，不适宜作为胸部爆震伤模子；B组6 h内弃世亡率仅为33.3%，受伤水平严重，能够反映胸部爆震伤病情转变特点，较为安定，适互助为室内胸部爆震伤动物模子.

    3.2病理心理转变爆炸后犬最较着的症状为低氧血症和休克. 爆炸后肺内血管割裂，肺内出血严重，红细胞、白细胞布满了肺泡腔及肺间质，未出血的肺机关不单有肺泡代偿性扩张，还有肺泡融合，肺泡细胞断裂，呈气肿样转变，导致了肺通气与血流比例失踪调，两者配合导致了低氧血症，同时肺泡结构转变引起肺血管阻力增高，形成肺动脉高压；低氧血症引起心肌缺氧，心肌缺氧和肺动脉高压导致了心脏指数降低，心脏指数降低和迷走神经反射导致心动过缓，同时迷走神经禁止四周血管缩短，使血压维持在低水平，切断双侧迷走神经后打击波仅能引起轻细的心动过缓［10］. 全数致伤犬未发现显显肺水肿样转变，各组犬肺含水量无较着差别，提醒6 h以内以出血为主，肺水肿不较着. 全数致伤犬爆炸后肺水溶性总卵白含量较着增高，谷胱苷肽含量较着淘汰，概略的缘故原由是血液中所含水溶性卵白较多所致. 谷胱苷肽的存在状况是细胞功效性和保留力的高度敏感指示器，能够招架自由基对细胞的损伤，谷胱苷肽淘汰提醒肺机关内自由基增多，在治疗时给以抗自由基药物是有扶助的.

    3.3密闭空间爆炸与坦荡空间爆炸本实施用传感器详尽记实了爆炸波及反射波超压强度,以斗劲密闭空间爆炸与坦荡空间爆炸的区别. 爆炸时反射波衰减很快，多个效应器未丈量到反射波，仅有反射波最强的2.6 m处测到小剂量反射波，远低于致伤超压，是以，室内爆炸发生的反射超压波的效应较弱. 但因为室内爆炸所发生的巨高声响是坦荡空间爆炸所无法对比的，巨高声响所致高应激反映会使爆炸后动物的心理病理转变加倍巨年夜，别的，室内爆炸消耗年夜量室内氧气，同时发生浓密的爆炸烟雾，在不操纵抽风机的情形下，室内低氧、浓烟雾状况很难缓解，这无疑加重了致伤动物的缺氧状况，同时还会导致肺吸入性损害.
 

【参考文献】
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