肿瘤的实验诊断进展

作者：潘玮，王晶，张志勇，张雪莹

【关键词】  肿瘤 实验诊断

近些年来，肿瘤对人类健康和生命的威胁很大，已经成为医学上的难关之一，是除心血管疾病以外造成人类死亡的主要病因。肿瘤治疗的关键在于早期诊断，实验诊断在肿瘤的早期诊断中十分重要，本文对目前肿瘤诊断方法的现状及进展做一个较为全面的阐述。

    1  病理学诊断

    到目前为止，病理学诊断仍是肿瘤诊断中最有效、最可靠的方法，被公认为黄金诊断标准，甚至有人把病理医生形容为医学上的法官［1］。近年来，随着科学的发展，病理学的观察方法及其采用的新技术有了一定的进展，主要表现在：（1）免疫组化技术从多克隆抗体到单克隆抗体、从冰冻切片到石蜡切片等一系列技术上的改进。（2）电子显微镜技术，具有强大的分辨能力，使人们对超微观世界的认识提高到一个崭新的水平。近年来，还出现了电镜技术与免疫技术相结合的免疫电镜技术，为病理学诊断带来了更为丰富的技术手段。（3）20世纪末病理图像分析技术的出现，使病理学诊断由定性逐步走向定量。有研究表明［2］自动图像分析系统是一个快速的分析系统，其灵敏度比流式细胞仪更高。（4）光谱核分析（SKY），一种崭新的细胞遗伟学研究技术，该技术可在一次杂交中用不同的颜色分辨全部24种人类染色体，特异性和分辨率比传统的显带技术要高许多，该技术可作为传统细胞遗传学方法的补充。

    2  肿瘤标志物的实验室诊断

　　传统的肿瘤标志物主要包括以下五类：（1）蛋白质类；（2）糖类抗原；（3）神经节苷脂类及其组分；（4）酶类；（5）激素类。而近年来出现的许多检测肿瘤标志物或其活性的新方法主要有下述三种。

    2.1  端粒酶活性的检测  在目前的肿瘤标志物中，端粒酶是惟一能在大部分肿瘤中都以高阳性率检测到的物质，因此端粒酶是一个很好的肿瘤诊断标志［3］。

    端粒酶常用检测方法有：（1）TRAP法。该方法非常敏感，现在有人把实时PCR技术与传统的TRAP法相结合发明了实时定量TRAP法（RQ-TRAP），能够对端粒酶活性进行较精确的定量，为良恶性肿瘤的鉴别诊断提供了有效的手段［4］。但由于设备和试剂很昂贵，目前还难以普及。（2）端粒酶mRNA检测。人端粒酶活性与两个成分的表达有关，一个是人类端粒酶RNA（hTR）,另一个是人类端粒酶催化亚基（hTERT）,用hTERT mRNA来评估端粒酶活性更为常用。（3）hTERT蛋白检测。hTERT蛋白在细胞内含量很少，但Hiyama等［5］用免疫组织化学法于存档的石蜡包埋标本中在细胞水平上成功检测到了hTERT蛋白，说明hTERT的免疫组织化学法可以作为回顾性研究手段。

    2.2  性激素受体的检测  胃肠道肿瘤诊断的传统方法往往是通过胃镜或结直肠镜采集组织标本来进行病理诊断。在采集组织标本时，病人痛苦较大，并有可能出现消化道出血等并发症。检测外周血白细胞雄激素受体的方法为诊断胃肠道恶性肿瘤提供了一种损伤较小且易于被患者接受的新方法，值得推广应用［6］。

    2.3  蛋白质组学的应用  肿瘤的变异基因的表达并不一定在生命的最终表现形式蛋白质的功能上反映出来，且蛋白质存在磷酸化、乙酰化等翻译后修饰，这些改变在转录水平上是无法检测的，而以高通量结合生物信息学为特点的蛋白质组学分析技术可以从细胞整体水平上检测到这种变化［7］。蛋白质组学研究的常用技术包括蛋白质的分离和鉴定两部分，主要有双向凝胶电泳（2－DE）和质谱（MS）技术。其中双向电泳是蛋白质组学研究的核心技术之一，由于其具有高分辨率和高灵敏度，已成为分析复杂蛋白混合物的基本工具。最近几年，利用激光捕获显微切割技术（LCM）可以获得单一的肿瘤组织细胞，LCM和2－DE结合成为当前应用最普遍的肿瘤蛋白质组学研究方法之一［8，9］，优势在于避免了其他蛋白成分对双向电泳结果的影响，提高了分辨率，并有助于比较正常组织和肿瘤组织蛋白质表达的差异。

    3  基因诊断

　　基因诊断的主要方法有多聚酶链反应（PCR）技术、核酸杂交、生物芯片等。目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，结果的准确性也有很大提高。至今为止，生物信号平行分析最成功的形式是基因芯片，目前的基因芯片有两类：一类是片上就位合成寡聚合苷酸点阵芯片（ONA）；另一类是用微量点样技术制作cDNA点阵芯片（CDA）［10］。该技术具有快速、敏感、高效、平行、自动等特点，将成为新一代基因诊断技术。近年来，基因诊断已取得了一定的进展，主要反映在基因突变的检测、基因过量表达的检测、肿瘤微卫星不稳定性分析、肿瘤的易感性预测、病因检测、早期诊断、肿瘤疗效的监测及预后判断等方面。

　　4  流式细胞术的诊断流式

　　细胞术（FCM）检测具有准确、快速、灵敏的特点，采用数学模型分析其群体的各细胞周期比率和具体分布，使各样本结果间具有较高的可比性。

    4.1  细胞周期和DNA倍体分析  肿瘤细胞DNA非整倍体是恶性肿瘤的特征性标志之一，因此可根据DNA倍体数及细胞周期各时相比率来反应肿瘤的良、恶性和分化程度。检测和分析细胞核DNA含量，对癌前病变的分析，对弥补病理动态学检测的困难提高肿瘤早期诊断，对恶性肿瘤的病理诊断、恶性程度判断、疗效及预后的估价均有重要的意义。

    4.2  膜抗原的分析  与肿瘤研究有关的膜抗原分析有以下几个方面：造血系统肿瘤的分型、癌基因表达产物、多药耐药基因的表达产物、肿瘤相关抗原、激素受体、淋巴细胞亚群以及与癌细胞生物行为有关的因子等。膜抗原的检测需要特异性的单克隆抗体，这些抗体被标上各种荧光探针，带有相应抗原的细胞通过单抗与荧光探针相结合，从而在流式细胞仪上可以测出这些膜抗原的表达水平［11］。

    4.3  细胞凋亡分析  细胞凋亡在肿瘤发生、发展及治疗中的作用引起了人们的极大关注，诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤学研究的一大热点。流式细胞术因为其简捷、灵敏、直观等特点成为细胞凋亡分析的重要工具［12］。

    4.3.1  细胞核内DNA断裂档记分析  细胞凋亡过程中细胞核内的DNA出现断裂，断裂点暴露出DNA分子的残端，用末端转移酶（TdT）或者缺口连接酶都可以标记上可以识别的化学物质。标记DNA断裂的3'－羧基末端，常采用由DNA聚合酶Ⅰ催化的原位缺口转移（ISN）或用TdT介导的dUTP原位缺口末端标记（TUNEL）技术。1SNT和TUNEL法均可进行间接或直接标记，间接标记灵敏度较高，但比直接标记复杂。

    4.3.2  AnnexinV探针杂交分析  此方法以AnnexinV磷脂结合蛋白作为探针识别细胞膜表面磷脂酰丝氨酸。细胞凋亡早期，细胞表面发生变化，细胞膜内部的磷脂酰丝氨酸（PS）可以迁移到细胞外层表面。AnnexinV是一种Ca离子依赖的，对PS有高度亲和力的磷脂结合蛋白，可作为探针识别细胞膜是否有PS，识别凋亡细胞。

    4.3.3  癌基因蛋白的检测  细胞凋亡与细胞增殖、分化一样，也受着基因的调控，大量的实验研究证明，凋亡与细胞内多种信使及多种癌基因蛋白有关。凋亡的信息是通过一系列信息传导通路到细胞而启动细胞凋亡的，已知凋亡调控基因要分为两大类诱导基因（如Fas基因）和抑制基因（如突变的P53基因），因此，细胞凋亡调控基因表达产物的FCM检测对肿瘤的易感性、疗效、预后有一定意义。

    5  展望

　　综上所述，随着分子生物学、免疫学等基础研究向癌症领域的渗透，癌症的诊断技术有了很大进步，为癌症患者的早期诊断、治疗带来了新的曙光。

【参考文献】
  1 刘鲁明，孟志强，陈震.肿瘤科疾病临床诊断与鉴别诊断.北京：科学技术文献出版社，2005,19-25.

2 Crisp H,Burton JL,Stewart R,et al.Refining the diagnosis of hydatidiform mole:image ploidy analysis and p57KIP2 immunohistochemistry.Histopathology,2003,43（4）:363-373.

3 顾栋桦，郑庆玲，朱虹光.端粒酶作为肿瘤标志物在病理学诊断中的应用.国外医学·肿瘤学分册，2004，31（6）:412-414.

4 Hou M,Xu D,Bjorkholm M,et al.Real-time quantitative telomeric repeat amplification protocol assay for the detection of telomeraseactivity.Clin Chem,2001,47（3）:519-524.

5 Hiyama E,Hiyama K,Yokoyama T,et al.Immunohistochenical detection of telomerase（hTERT）protein in human cancer tissues and a subset of cells in normal tissuse.Neoplasia,2001,3（1）:17-26.

6 郭俊明，肖丙秀.循环血中肿瘤标志物检测的进展及其临床意义.自然杂志，2002,24（5）:265-268.

7 乔滨，王文静.蛋白质组学及其研究技术在肺癌分子生物标志物研究中的应用.中国癌症杂志，2006,16（1）:63-65.

8 倪晓光，赵平，刘煜，等.蛋白质组学在实体肿瘤标志物研究中的应用.癌症,2003,22（6）:664-667.

9 Craven RA,Totty N,Harnden P,et al.Laser capture microdissection and two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis:evaluation of tissue preparation and sample limitations.Am J Pathol,2002,160（3）:815-822.

10 杜金荣.病理技术的新进展.黑龙江医学，2005,29（4）:241-243.

11 吴一峰，钱凯先.荧光探针在流式细胞术检测肿瘤中的应用.浙江大学学报（工学版），2003,37（5）:617-622.

12 Chen Q,Pen GW ,Xu A.Apoptosis of a human non-small cell lung cancer（NSCLC）cell line,PLA-801,induced by acutiaporberine,a novel bisalkaliod derived fromThalict rumacutifolium （Hand.2M azz.）Boivin.Biochemical Pharmacology,2002,63:1389-1396.