C型凝集素受体CLEC-2的研究进展

　　0 引言
　　
　　C 型凝集素受体是模式识别受体中一类重要的家族，具有一个或多个C 型凝集素样结构域（C-type lectin-like domains，CTLDs），也即位于C 型凝集素受体上，含有序列同源的碳水化合物识别域（carbohydrate recognition domain, CRD）。根据该识别域是否依赖Ca2+可将其分为经典和非经典两大类。前者可识别糖链结构，而后者则识别多肽和脂类，而非糖配体。C 型凝集素样受体CLEC-2（C-type lectin-like receptor-2）是新发现的一种非经典C型凝集素受体，由于其特殊的结构和功能受到国内外广泛学者的关注。本文将集中阐述CLEC-2 的生物学特性及其功能。
　　
　　1 CLEC-2 的发现
　　
　　CLEC-2 是Colonna M 等人于2000 年通过使用含有免疫学功能的C 型凝集素结构域筛选基因组数据库组时被鉴定的，进一步通过多种方法证实并命名为CLEC-2。研究表明CLEC-2 的mRNA 在肝脏以及其他造血细胞上表达，包括单核细胞、树突状细胞（dendriticcell, DC），自然杀伤细胞（NK cell），以及中性粒细胞[1]。进一步研究发现，血小板表面也可大量表达CLEC-2，运用CLEC-2 抗体与其受体的结合可进一步证明CLEC-2 的激活可单独介导血小板的活化和聚集，这也是现有研究所得出的CLEC-2 的最主要功能[2]。KerriganAM 等人的研究证明CLEC-2 也可微量表达于骨髓细胞和被炎症所激活的中性粒细胞表面，可通过与抗体结合介导吞噬并产生包括TNF-α 在内的多种细胞因子[3]。但其介导的生理功能仍未阐明。
　　
　　2 CLEC-2 的结构
　　
　　人 CLEC-2(hCLEC-2)是32kDa 的II 型跨膜受体，其基因定位于人12p13.2 上，cDNA全长820bp，编码框690bp，编码229 个氨基酸，位于自然杀伤细胞基因复合体（NKC）内[1]。人类与小鼠的CLEC-2 具有高度的同源性，都含有C 型凝集素样结构域的保守位点和胞内域的D-x-Y-x-x-L 序列，但其pre-mRNA 的剪切调节机制存在一定的差异性。在人细胞中存在两个选择性剪切异构体，而鼠中存在三个。现已知鼠的CLEC-2 编码基因包括6 段外显子，分别编码胞内域、跨膜区、颈部和CRD。除全长亚型的CLEC-2 蛋白（CLEC-2A）外，还发现了另两种截短的同源异型蛋白，分别命名为CLEC-2B 和CLEC-2C。从组织细胞水平来看，CLEC-2A 主要表达在脾、肝和骨髓细胞中；CLEC-2B 在不同组织中都有表达，但表达水平存在差异，细胞中主要表达在Raw264.7（巨噬细胞系）和CTLL-3（T细胞系中）；而CLEC-2C 则主要表达在肺和肾组织中。从亚细胞水平上来看，CLEC-2A 主要为跨膜蛋白，而CLEC-2B 和CLEC-2C 则定位于胞浆内[4]。人CLEC-2 为不含信号肽的蛋白质，翻译加工完成后，分子的N-端短片段留在细胞质内，通过跨膜区的作用使分子的大部分暴露在细胞表面[5]，但其剪切异构体的表达和功能尚无详细报道。
　　CLEC-2 有一个致密的CTLD，在其表面有一个可弯曲的环。长环区包括了3-10 个螺旋，半螺旋长环区域提供了最初的配体识别和黏附，具有折叠性。其半螺旋长环区和侧翼的残基占据了用于配体结合的表面区域。配体结合可诱导在长环区内的3-10 螺旋部分地倾斜。侧翼区域也进行一些运动，这样可以打开结合的表面。配体相互作用可能与表面的加宽相联系，有利于结合3-10 个螺旋的定向倾斜[6]。
　　
　　3 CLEC-2 的配体
　　
　　现发现的 CLEC-2 外源性配体主要有蛇毒和HIV 病毒两种。马来西亚蝮蛇（Calloselasmarhodostoma）能产生一种蛇毒蛋白（rhodocytin），该蛇毒蛋白为一种C 型凝集素样蛋白，也被称为aggretin。该蛇毒蛋白介导的血小板活化最早被认为是通过胶原受体和整合素α2β1以及GPIb/IX/V 所介导的[8,9]。近年来对蛇毒rhodocytin 进行亲和层析，发现CLEC-2 也是蛇毒rhodocytin 的一种血小板表面受体。蛇毒rhodocytin 的2.4? 分辨率晶体结构表明它是由非二硫键相连的（αβ）2 四聚体。该四聚体可促使CLEC-2 受体在血小板表面的聚集，通过触发一系列信号传导激活血小板，引起血小板的活化和聚集[2,6,10]。
　　除了rhodocytin 以外，HIV-1 也是CLEC-2 的外源性配体。CLEC-2 可以在病毒外壳蛋白存在的情况下俘获HIV-1，而被俘获的HIV-1 可以逃避细胞对其的降解作用而在细胞内存活2-3 天或更长时间。血小板通过DC-SIGN 和CLEC-2 两大受体的协同作用对HIV-1 病毒进行俘获和转运，从而导致了HIV-1 病毒在患者体内的播散[11]。
　　CLEC-2 的内源性配体目前仅发现一种名为podoplanin(也称为aggrus)的唾液酸糖蛋白，它与CLEC-2 的亲和力小于蛇毒rhodocytin。Podoplanin 是I 型跨膜唾液酸黏液素样糖蛋白，它的胞外结构域由162 个氨基酸残基组成，富含O-型糖基化位点，其胞内结构域则是由9个氨基酸残基组成的短链。podoplanin 第52 位苏氨酸的糖基化对血小板的聚集起着至关重要的作用。podoplanin 主要表达在肿瘤细胞的表面，包括鳞状细胞癌、精原细胞瘤以及脑瘤等，能够促使血小板的活化和聚集，从而在肿瘤细胞表面形成包裹样结构，使肿瘤细胞更容易逃避机体的免疫攻击，从而促进了肿瘤细胞的转移。另外，它也表达在淋巴管内皮细胞表面，在淋巴管的形成过程中发挥作用。因此，podoplanin 表面O 型糖基化位点上的唾液酸参与了与CLEC-2 的结合，从而介导了血小板聚集、肿瘤转移和其他相关细胞的应答[12,13,14]。但podoplanin 的具体生理功能以及podoplanin 与CLEC-2 作用后所产生的效应仍有待进一步研究。
　　
　　4 信号通路
　　
　　CLEC-2 在其胞内域存在一个形如免疫受体酪氨酸活化基序（ immunoreceptortyrosine-based activation motif, ITAM,YXXL-(X)10-12-YXXL）的结构。但是，经典的ITAM 含有一对酪氨酸残基，而CLEC-2 仅含有一个，成为非典型ITAM 基序[5]。由于Syk 酪氨酸激酶含有两个SH2（Src 二聚体2）结构域，其活化需要两个磷酸化的酪氨酸残基，因此，CLEC-2的活化往往通过其颈部的半胱氨酸残基形成同源二聚体，这一方面有利于配体的结合，另一方面弥补其胞浆尾部酪氨酸残基数量不足的缺点，保证信号的有效传递[15,16]。
　　R406 为Syk 的抑制剂，对Syk 具有高度的特异性，由于R406 可以抑制CLEC-2 酪氨酸的磷酸化和信号的传递，因此可以推测在CLEC-2 介导的血小板活化的过程是由Syk 和Src 所共同参与的[17]。通过Src 对酪氨酸的磷酸化，酪氨酸激酶Syk 结合到SH2 结构域，从而引起Syk 的激活，并引起下游LAT，SLP-76，Vav3，Btk 以及磷脂酶γ2（phospholipaseγ2,PLCγ2）酪氨酸的磷酸化，从而介导信号的快速传递。CLEC-2 也是第一个被发现的在血小板表面通过这条特异的信号途径传递信息的C 型凝集素受体[2]。
　　Ruan Y 等人通过研究发现，RACK1（the receptor for activated C-kinase 1，活化C 激酶1 受体）可以和CLEC-2 的胞内结构域相互作用，从而影响CLEC-2 的表达。RACK1 可以选择性促进胞内的CLEC-2 降解，并不影响它在细胞表面的表达。但RACK1 的过表达会通过促进其泛素蛋白酶体的降解从而降低CLEC-2 的稳定性[18]。
　　
　　5 临床意义
　　
　　正如前文所述，CLEC-2 可俘获HIV-1，并介导HIV-1 在体内的散播，因此研究CLEC-2有助于进一步阐明HIV-1 在体内的播散途径，进而对其进行干预和治疗；另外，CLEC-2 与podoplanin 的相互作用可介导肿瘤细胞的转移和血小板的聚集，因此推测CLEC-2 和podoplanin 可作为抗肿瘤转移药物作用的靶蛋白。由于CLEC-2 主要表达在血小板细胞和巨细胞表面，在介导血小板的活化和聚集的过程中起着非常重要的作用，因此可以推测CLEC-2在血栓性和出血性疾病的发生发展中占有举足轻重的地位。虽然直接引起血小板活化的内源性配体仍未阐明，但对CLEC-2 的进一步研究将为治疗血栓性和出血性疾病的治疗提供新的方案[19]。
　　综上所述，CLEC-2 可作为治疗相关疾病的靶蛋白。因此，通过作用于CLEC-2 的信号通路从而干预其信号的传递，或直接作用于胞外区的受体识别域或许可以达到相应的治疗目的。作用于CLEC-2 特异性的信号通路可以阻断CLEC-2 信号的下传，从而抑制血小板的活化。但还未有相关报道阐明这种特异性的靶点。阻断现已知的信号通路虽然可以起到相同的作用，但也会阻断其他受体相同的信号通路，产生相关的副作用，如免疫抑制等。但若疾病严重，权衡利弊则可以采用该治疗手段。相比之下，直接作用于胞外区受体识别域则更具有特异性。利用单克隆抗体、重组蛋白或者小分子蛋白物质都可以特异性阻断或者激活CLEC-2受体，从而起到相应的治疗作用[7]。
　　
　　6 结论
　　
　　CLEC-2 是一个非经典型的C 型凝集素受体，主要表达在血小板、中性粒细胞等细胞表面，能形成二聚体与rhodocytin、HIV 和podoplanin 等相关配体结合，引起其胞内域酪氨酸位点磷酸化，激活Syk 并引起下游信号的传递，从而促进血小板活化聚集、肿瘤转移、细胞因子的分泌等生理和病理生理变化。近年来CLEC-2 等C 型凝集素受体受到国外广大学者的关注，国内对其研究起步较晚但发展迅速，但仍许多问题有待解决，例如人CLEC-2(hCLEC-2)的剪切异构体及其表达和具体功能；信号通路中的特异性靶点；特异性单克隆抗体的制备以及CLEC-2 的其他生理功能等等。对CLEC-2 的进一步研究有利于为临床肿瘤和血栓、出血性疾病的治疗提供新的思路和理论指导。

　　
　　参考文献
　　[1] COLONNA M, SAMARIDIS J, ANGMAN L. Molecular characterization of two novel C-type lectin-likereceptors, one of which is selectively expressed in human dendritic cells[J]. Eur J Immunol, 2000, 30:697–704.
　　[2] SUZUKI-INOUE K, FULLER GL, GARCIA A, et al. A novel Syk-dependent mechanism of plateletactivation by the C-type lectin receptor CLEC-2[J]. Blood, 2006, 107: 542–9.
　　[3] KENIGAN AM, DENNEHY KM, MOURAO-SA D, et al. CLEC-2 is a phagocytic activation receptorexpressed on murine peripheral blood neutrophils[J]. J Immunol, 2009, 182(7): 4150-7.
　　[4] XIE J, WU T, GUO L, et al. Molecular characterization of two novel isoforms and a soluble form of mouseCLEC-2[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2008, 371: 180–4.
　　[5] FULLER GL, WILLIAMS JA, TOMLINSON MG, et al. The C-type lectin receptors CLEC-2 and Dectin-1,but not DC-SIGN, signal via a novel YXXL-dependent signaling cascade[J]. J Biol Chem, 2007, 282:12397–409.
　　[6] WATSON AA, BROWN J, HARLOS K, et al. The crystal structure and mutational binding analysis of theextracellular domain of the platelet-activating receptor CLEC-2[J]. J Biol Chem, 2007, 282: 3165-72.
　　[7] O’CALLAGHAN CA. Thrombomodulation via CLEC-2 targeting[J]. Curr Opin Pharmacol, 2009, 9: 90-5.
　　[8] SUZUKI-INOUE K, OZAKI Y, KAINOH M, et al. Rhodocytin induces platelet aggregation by interactingwith glycoprotein Ia/IIa (GPIa/IIa, Integrin alpha 2 beta 1). Involvement of GPIa/IIa-associated src andprotein tyrosine phosphorylation[J]. J Biol Chem, 2001, 276: 1643-52.
　　[9] NAVDAEV A, CLEMETSON JM, POLGAR J, et al. Aggretin, a heterodimeric C-type lectin fromCalloselasma rhodostoma (Malayan pit viper), stimulates platelets by binding to alpha 2 beta 1 integrin andglycoprotein Ib, activating Syk and phospholipase Cgamma 2, but does not involve the glycoprotein VI/Fcreceptor gamma chain collagen receptor[J]. J Biol Chem, 2001, 276: 20882-9.
　　[10] WASTION AA, EBLE JA, O’CALLAGHAN CA, et al. Crystal structure of rhodocytin, a ligand for theplatelet-activating receptor CLEC-2[J]. Protein Sci, 2008, 17(9): 1611-6.
　　[11] CHAIPAN C, SOILLEUX EJ, SIMPSON P, et al. DC-SIGN and CLEC-2 mediate human immunodeficiencyvirus type 1 capture by platelets[J]. J Virol, 2006, 80: 8951–60.
　　[12] KATO Y, KANEKO MK, KUNITA A, et al. Molecular analysis of the pathophysiological binding of theplatelet aggregation-inducing factor podoplanin to the C-type lectin-like receptor CLEC-2[J]. Cancer Sci,2008, 99: 54–61.
　　[13] TSURUO T, FUJITA N. Platelet aggregation in the formation of tumor metastasis[J]. Proc Jpn Acad Ser BPhys Biol Sci, 2008, 84: 189–98.
　　[14] SUZUKI-INOUE K, KATO Y, INOUE O, et al. Involvement of the snake toxin receptor CLEC-2 inpodoplanin-mediated platelet activation by cancer cells[J]. J Biol Chem, 2007, 282: 25993-6001.
　　[15] WATSON AA, CHRISTOU CM, JAMES JR, et al. The platelet receptor CLEC-2 is active as a dimmer[J].Biochemistry, 2009, 48(46):10988-96.
　　[16] HUGHES CE, POLLITT AY, MORI J, et al. CLEC-2 activates Syk through dimerisation[J]. Blood, 2010.[Epub ahead of print]
　　[17] SPALTON JC, MORI J, POLLITT AY, et al. The novel Syk inhibitor R406 reveals mechanistic differencesin the initiation of GPVI and CLEC-2 signaling in platelets[J]. J Thromb Haemost, 2009, 7(7):1192-9.
　　[18] RUAN Y, GUO L, QIAO Y, et al. RACK1 associates with CLEC-2 and promotes its ubiquitin-proteasome