合募配穴针刺后胃溃疡大鼠胃组织纳升级二维液相色谱研究
1 引言
针灸疗法被广泛用于治疗胃溃疡及溃疡复发[1]。蛋白质组学技术已经被用于针灸防治胃溃疡的机理研究[2]。本文从合募配穴治疗胃溃疡的有效性出发，利用Nano-2D-LC 技术对应激性胃溃疡大鼠进行针刺治疗，取出针刺治疗后的胃组织，利用该组织的匀浆液进行蛋白质组研究，以揭示针灸防治胃溃疡的现代生物学机制。
2 材料与仪器
2.1 动物
清洁级雄性 Wistar 大鼠35 只，体重200±30g，由长春高新医学动物实验研究中心提供，实验动物合格证号：0003845。
2.2 试剂和药品
乙腈（ACN，G.R.，Fisher Scientific Fairlawn），甲酸（FA，G.R.，Fluka），胰蛋白酶（Trypsin, Sigma, St.Louis, MO），牛血清白蛋白（BSA, A.R., Sigma），苯甲基磺酰氟（PMSF,A.R., Amresco），醋酸铵（NH4AC, A.R.，北京化工厂），碳酸氢铵（NH4HCO3，A.R.，北京化工厂）
2.3 实验仪器
Agilent 1100 纳升级多维液相分析系统，美国Agilent 公司产品。
3 方法
3.1 实验动物及分组
将35 只大鼠分为如下5 组，每组7 只：分别是A：空白对照组；B；应激性胃溃疡模型组；C：募穴组(中脘组)；D：下合穴组（足三里组）；E：合募配穴组（中脘穴配足三里穴组）。
3.2 穴位选取和针刺治疗
“足三里”、“中脘”的选取参照大鼠常用针灸穴位定位标准[3]。按照分组要求，各组大鼠依照分组所取穴位，合募配穴组取“足三里穴”加“中脘穴”针刺，下合穴组取“足三里穴”针刺，募穴组取“中脘穴”针刺，均采用平补平泻针法治疗，每日1 次，每次留针20 分钟，连续施术2 天；模型组每日同样抓取，不针刺；空白对照组正常喂养，不予处理。
3.3 模型复制方法
依据文献进行模型复制[4]：将所有实验大鼠造模前禁食不禁水24h，将B、C、D、E 大鼠四肢捆绑固定于木板上，将木板直立浸于23±1℃的恒温水槽中，液面保持在大鼠胸骨剑突水平；A 组大鼠不予处理；B、C、D、E 组大鼠同时浸泡；5 组大鼠于24h 后断颈处死。
3.4 样品制备
3.4.1 鼠胃组织蛋白提取
将 35 只大鼠用颈椎脱臼法处死后，迅速剪取溃疡部胃组织，用冰的生理盐水冲洗3 次以除去体液及血液中一些可能的污染物。用滤纸吸净多余水分，将鼠胃组织切成约3mm3 小块，接着称重，以1：8(g：ml)的比例加入提取液（含1mmol/L PMSF 的水溶液）后用玻璃匀浆器对胃组织进行匀浆。匀浆液在冰浴中混悬20min，然后在4℃条件下以13000rpm 离心10min。收集上清液，贮存在-80℃留待下一步使用。
3.4.2 鼠胃组织匀浆液总蛋白含量测定
采取 Bradford 法[5]，以牛血清白蛋白作标准品，用SmartSpec3000 分光光度计进行定量。
3.4.3 酶解反应
取 10μl 样品，用100mmol/L NH4HCO3 水溶液调节其pH 值至7.5~8 后，煮沸5min，加入15%ACN，冷至室温，将胰蛋白酶加入该溶液中，使样品与胰蛋白酶的质量比为40：1。
该样品液在37℃水浴条件下过夜后，滴入甲酸使pH 值至3~4 以终止酶解反应。
3.5 蛋白质酶解物的纳升级二维液相色谱分离
第一维强阳离子交换（Strong Cation-Exchange ,SCX）色谱柱采用Agilent ZORBAXBio-SCX SeriesⅡ(50×0.8mm,3μm)，上样液与纳升级分析型反相液相色谱流动相A 相同，即流动相A：H2O-ACN-FA(体积比为95：5：0.1)溶液。洗脱液为0.5mol/L 的NH4Ac，洗脱15min，流速：10μl/min。
富集柱：C18 柱为Agilent ZORBAX 300SB(50×0.3mm,5μm)。样品的预浓缩和除盐时所用的溶液与纳升级液相色谱流动相A 相同。
第二维纳升级分析型 RPLC 柱C18 柱为Agilent ZORBAX SB(150×0.5mm,5μm)。所用流动相A 为H2O-ACN-FA(体积比为95：5：0.1)溶液；B 液为H2O-ACN-FA(体积比为5：
95： 0.1)溶液，线性梯度洗脱程序：0-15min，上样除盐；15-25min，0%B-50%B；25-35min，50%B-99%B；35-45min，99%B-0%B，流速4μl/min，多波长检测器（Multiwavelength Detector，MWD），检测波长214nm。
第一维采用SCX 柱，通过0.25mol/L 的NH4Ac 溶液置换，由富集柱除盐吸附组分后反冲入第二维反相液相色谱柱线形洗脱，最后进入多波长检测器分析。
4 结果
5 组酶解液所有成分的色谱峰在40min 内出完，比较5 组色谱图（见图1）。图1 是5组样品重叠比较的色谱图。观察空白组、模型组和各治疗组色谱图，在保留时间27min~32min较4组间5个色谱峰峰面积大小（见图1），可见模型组与治疗组相比，5个共有峰的各个峰面积对应减小，详细数据见表2。共有峰1、2、3、4、5的峰面积积分在模型组、募穴组、下合穴组和合募配穴组中呈现逐渐减小趋势，组间峰面积积分比较均有非常显著性差异(P<0.01)，并且合募配穴组峰面积积分最小，最接近正常状态。
5 讨论
中医针灸疗法在治疗胃溃疡中具有很好的疗效，特别是选取中脘、足三里等穴配伍治疗胃溃疡等疾病效果显著[6]。但目前针刺防治胃溃疡机理研究多局限于胃功能或胃局部改变为对象，或以单一指标改变进行观察，研究结果难以体现中医“胃腑”的整体功能变化规律，更难反映“胃腑”与其它脏腑的密切联系和相互作用。由于针灸效应的整体性，仅从单个蛋白的静态研究难以全面反映针灸效应的整体变化，因此改变以往单个蛋白的静态研究而从蛋白质组的整体变化研究针灸的效应将是针灸学研究的一个突破口。高通量的蛋白质组学理论与技术为这一研究创造了良好的工作平台。
本实验结果显示，空白组与模型组和治疗组色谱图比较，在保留时间27min～32min时，模型组、募穴组、下合穴组及合募配穴组具有5个多肽峰保留时间基本一致，各峰在4组间的保留时间差小于0.5min，峰1、2、3、4、5的保留时间在4组间均无显著性差异（P>0.05），故确定为共有多肽峰。在空白对照组中未见这5个共有峰，提示共有峰属于大鼠病理状态下产生的5种特异性多肽。
比较4组间5个色谱峰峰面积积分，共有峰1、2、3、4、5的峰面积积分在模型组、募穴组、下合穴组和合募配穴组中呈现逐渐减小趋势，组间峰面积积分比较有非常显著性差异(P<0.01)，并且合募配穴组峰面积积分最小，最接近正常状态。通过比较发现，针刺后5种特异性多肽峰的峰面积积分都明显减小，并且针刺足三里穴比针刺中脘穴的减小程度大，合募配穴组比单纯针刺中脘或足三里穴对其峰面积积分减小的程度更大，表明针刺能够减小这5种多肽的含量，并且针刺中脘穴、足三里穴及中脘穴配足三里穴对5种多肽含量减小的程度依次增大，合募配穴比单纯选用下合穴或募穴对5种特异性多肽的作用强，提示针刺对应激性胃溃疡的治疗机制可能与这5种多肽含量的减小有关，合募配穴比单用下合穴或募穴对应激性胃溃疡的治疗作用更强，即合募配穴的疗效优于单纯针刺中脘穴或足三里穴，同时单纯针刺足三里穴的疗效优于单纯针刺中脘穴，这与胃溃疡等胃腑疾病的临床表现和针灸治疗胃腑疾病的实践相一致。