小探弓形虫速殖子与缓殖子相互转化

　　弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种机会性致病原虫，在宿主免疫功能正常的情况下，入侵的弓形虫速殖子通常转化为缓殖子，形成包囊，宿主成为隐性感染状态；当宿主免疫功能受损或低下时，如艾滋病患者、恶性肿瘤患者等，包囊内的缓殖子能活化转化为速殖子，可引起宿主的急性弓形虫病发作，严重者可导致死亡。弓形虫速殖子与缓殖子相互转化的机制目前尚不清楚，由于用动物模型研究比较复杂，体外培养成为国内外弓形虫研究的常用方法。本室在国内外研究的基础上，成功建立弓形虫RH 株体外培养及速殖子与缓殖子相互转化的体系，报告如下：

　　1.1 材料
　　1.1.1 虫株、细胞系及实验动物
　　弓形虫RH 株和NIH3T3 细胞系为本室保种，雌性昆明系小鼠（6～7 周龄）由南方医科大学实验动物中心提供。
　　1.1.2 主要试剂及仪器
　　DMEM培养基为GiBco 公司产品，青霉素、链霉素、胰酶为Hyclone公司产品，Hepes 为Amresco 公司产品，新生牛血清为杭州四季清生物工程材料有限公司产品，Trizol 试剂为Invitrogen 公司产品，Oligo dT、反转录酶M-MLV、pMD-18-T 载体为TaKaRa公司产品，荧光倒置显微镜TE2000-S 为Nikon 公司产品。
　　1.1.3 引物
　　根据发表的弓形虫缓殖子期特异抗原缓殖子蛋白1（Bradyzoite antigen 1，BAG1）的mRNA 序列（ GenBank 登录号： X82213 ） 设计引物， 上游引物P1 ：
　　5'-ATCGGAATTCATGGCGCCGTCAGCATCG-3' ， 下游引物P2 ：
　　5'-CTGACCCGGGCTTCACGCTGATTTGTTG-3'，引物由上海生物工程有限公司合成。

　　1.2 方法
　　1.2.1 弓形虫速殖子的收集及纯化
　　复苏液氮冻存的弓形虫RH 株速殖子，接种小鼠腹腔，连续转种3 代后，用生理盐水冲洗小鼠腹腔，腹腔冲洗液2500r/min 离心10min 收集速殖子，沉淀用生理盐水漂洗1 次，离心去上清，再用10ml 生理盐水重悬沉淀，用4.5 号针头注射器反复抽吸虫体悬液20～30 次，孔径3μm 滤膜过滤虫体悬液，显微镜下检查过滤虫体纯度。
　　1.2.2 弓形虫速殖子的体外培养
　　将纯化速殖子按照1：10 比例接种于NIH3T3 细胞单层（NIH3T3 细胞的培养条件为pH7.2 的DMEM 培养基，其中含16.4mmol/L Hepes，100u/ml青霉素，100mg/ml 链霉素，5％新生牛血清，NIH3T3 细胞生长达到60％～70％时接种弓形虫速殖子），置于37℃，5％CO2 的培养箱中培养，每隔2～3d 换液1 次，每隔5～6d 分瓶培养或收集速殖子。
　　1.2.3 速殖子向缓殖子的诱导转化
　　NIH3T3 细胞生长达到60％～70％，按照1：10 比例接种纯化的RH 株速殖子，接种4h 后，用pH8.1 的DMEM 培养基轻柔冲洗细胞单层，以移去未侵入细胞的弓形虫速殖子，再用pH8.1 的DMEM 培养基（含2.5％新生牛血清，其余成分同前），置于37℃空气中培养（培养箱温度设为37℃,进气口不输入CO2，而是与空气相通），每隔2～3d 换液1 次，培养96h。
　　1.2.4 诱导转化后缓殖子的鉴定
　　诱导转化96h 后，收集单层细胞，沉淀加入Trizol 试剂，按照Trizol 使用说明书提取总RNA，采用RT-PCR 的方法进行缓殖子期特异抗原BAG1mRNA 的检测。反应第一步以Oligo dT 为引物进行反转录，第二步以BAG1 基因特异引物进行PCR 反应，PCR 产物克隆到T 载体后送上海英骏公司测序。
　　1.2.5 碱性条件下速殖子向缓殖子诱导转化进程的监测
　　相同数量NIH3T3 细胞分别接种于5 个培养瓶，细胞生长达到60％～70％，按照上述方法每瓶细胞接种相同数量速殖子进行诱导，诱导第0h、24h、48h、72h、96h，分别取出一瓶细胞，弃去培养液，加入Trizol 裂解细胞，提取总RNA，以β-微管蛋白的mRNA RT-PCR 产物为参照，进行半定量RT-PCR 检测BAG1 基因mRNA，PCR 结果进行琼脂糖凝胶电泳，根据相对亮度，判定BAG1 基因mRNA的转录水平。
　　1.2.6 缓殖子向速殖子的诱导转化
　　将生长于pH8.1DMEM 下诱导的缓殖子培养环境更换为pH7.2 的DMEM 培养基，同时恢复37℃，5％CO2 的培养条件，并适当补充NIH3T3 细胞。
　　1.2.7 热休克处理诱导速殖子向缓殖子的转化
　　常规培养NIH3T3 细胞生长达到60％～70％，将培养瓶分别放入37℃、39℃、41℃、43℃，5％CO2 培养箱中培养3h 后，按照1：10比例接种纯化的RH 株速殖子，接种4h 后，用相应温度预热的DMEM 培养基轻轻冲洗细胞单层，以移去未侵入细胞的速殖子，然后分别放置在37℃、39℃、41℃、43℃，5％CO2 培养箱中培养48h，收集培养混合物，提取总RNA，进行RT-RCR。

　2 结果

　　2.1 弓形虫RH 株速殖子的收集和纯化
　　收集接种小鼠腹腔冲洗液，显微镜下可见大量新月形弓形虫速殖子及小鼠腹腔的巨噬细胞，腹腔液经过3μm 滤膜过滤后，显微镜检查速殖子纯度可达98%以上，但通过滤膜过滤虫体数量损失可达40％～50％左右。

　　2.2 弓形虫速殖子的体外培养
　　体外培养2～3d，可见溶液中出现少量游离的速殖子，NIH3T3 细胞中出现假包囊，少量宿主细胞开始被破坏，5～6d 后，游离速殖子大量增多，大部分宿主细胞被破坏。为进一步培养，需进行分瓶培养或在原瓶中补充适当NIH3T3细胞才能继续培养，否则在大部分宿主细胞被破坏，虫体密度过高，培养基的pH 值偏酸的环境下，弓形虫速殖子开始崩解死亡，数量急剧减少，培养基因含大量崩解产物而变浑浊。

　　2.3 速殖子向缓殖子诱导转化及鉴定
　　诱导96h 后，培养液中少见游离弓形虫速殖子，NIH3T3 细胞呈不规则圆形，胞浆中出现大小不等的圆形囊性小体，囊壁折光性较强。
　　提取诱导培养物总RNA，以RT-PCR 检测弓形虫缓殖子期特异抗原BAG1 的表达，可得到700bp 左右目的条带，PCR 产物克隆到T 载体后测序，测序结果与已发表的BAG1基因mRNA 同源性高达99.3％，无基因组组DNA 内含子序列，结果表明成功诱导缓殖子的形成（BAG1 基因的克隆表达另文发表）。

　　2.4 碱性条件下速殖子向缓殖子诱导转化进程的监测
　　用pH8.1 的DMEM 碱性培养基诱导速殖子向缓殖子转化，分别在诱导后第0h、24h、48h、72h、96h 提取培养物总RNA，进行RT-PCR，以弓形虫β-微管蛋白的RT-PCR 扩增产物为参照物，分析BAG1 mRNA 的转录水平。因五个培养瓶起始接种的NIH3T3 细胞和速殖子数量均相同，从结果中可以看出，随着诱导时间的延长，BAG1 mRNA 的转录水平逐渐提高，表明有更多的弓形虫速殖子向缓殖子转化。

　　2.5 缓殖子向速殖子的诱导转化
　　诱导形成的缓殖子恢复pH7.2 培养基及正常培养条件，24h 后可见溶液中出现游离弓形虫速殖子，部分速殖子侵入NIH3T3 细胞形成假包囊。
　　2~3d 后速殖子开始大量增殖，NIH3T3 宿主细胞开始被破坏，需适当补充NIH3T3 细胞才能继续培养。

　　2.6 热休克处理诱导速殖子向缓殖子的转化
　　NIH3T3 细胞经过预热处理后接种速殖子，分别在37℃、39℃、41℃、43℃中诱导培养48h。在39℃诱导条件下，NIH3T3 细胞生长相对37℃较快，镜下可见速殖子大量增殖，NIH3T3 细胞被破坏较快，培养液中游离的速殖子较多，48h 后，大部分NIH3T3 细胞被破坏，RT-PCR 未扩增出BAG1 mRNA 相应片段，结果表明39℃尚不能诱导缓殖子形成，39℃诱导条件还是适于RH 株速殖子的生长条件。
　　在43℃诱导条件下，大量NIH3T3 细胞变性，脱壁悬浮在培养液中，速殖子早期可见侵入细胞，培养液中少见速殖子，48h 后，基本上见不到贴壁细胞，培养液中悬浮的细胞大部分崩解，RT-PCR 未扩增出BAG1 mRNA 相应片段，结果表明在43℃条件下，NIH3T3 细胞难以生长，不能为速殖子提供一个稳定的细胞内环境，不利于RH 株速殖子向缓殖子的转化。
　　在41℃诱导条件下，NIH3T3 细胞生长缓慢，部分细胞也发生变性脱壁，但速度相对43℃诱导条件下较慢，培养液中少见速殖子，48h 后，部分细胞变性脱壁，悬浮在培养液中，培养液中可见少量速殖子，RT-PCR 扩增出BAG1 mRNA 相应片段，结果表明在41℃条件下，NIH3T3 细胞虽然也发生变性坏死，但速度想对较慢，能为速殖子提供一个相对稳定的细胞内环境，在41℃诱导下，弓形虫RH 株速殖子能转化为缓殖子。

　　3 讨论

　　速殖子与缓殖子的相互转化，是弓形虫机会性致病的生物学基础。目前相互转换的机制尚不清楚，探讨转化机制的研究成为弓形虫病研究的热点和难点之一。由于用动物模型研究转化机制比较复杂，随着体外弓形虫培养方法的不断改进，国内外学者多采用弓形虫体外培养系统进行研究。用于弓形虫体外培养的宿主细胞种类较多，如包皮成纤维细胞、Vero 细胞、Hela 细胞等。本实验采用NIH3T3 细胞，主要因为NIH3T3 细胞培养技术成熟，细胞易贴壁生长形成单层，镜下观察方便，对弓形虫感染和包囊形成影响不大。
　　实验研究表明，大多数弓形虫分离株可在体外培养环境下自发形成包囊，但这种自发形成的包囊数量很少，且不同分离株间有差异，弱毒株（如ME-49、Prugniaud、NTE 等）比强毒株（如RH 和BK 株等）更易形成包囊。本实验采用RH 株进行体外培养，在不改变培养条件下培养，未检测到缓殖子形成，这可能与弓形虫强毒株RH 株分裂增殖较快，毒力大，大量破坏宿主细胞有关。而在弓形虫RH 株感染NIH3T3 细胞后，改变培养基的酸碱度到pH8.1，则可诱导缓殖子期特异抗原BAG1 的表达，并形成包囊。这与Soete 等的研究结果相一致，说明体外碱性环境易于诱导弓形虫缓殖子的形成。
　　BAG1 是弓形虫缓殖子期特异蛋白，存在于缓殖子的胞浆中，在速殖子的cDNA 文库和速殖子的ESTs 中均检测不到BAG1 基因的转录。本研究采用RT-PCR 的方法检测到转化过程中BAG1 基因的表达，并且随着诱导时间的延长，BAG1 mRNA 的转录水平逐渐提高，说明有更多的速殖子向缓殖子转化，从分子水平证明弓形虫速殖子向缓殖子的诱导转化。
　　研究发现，热休克可诱导速殖子向缓殖子的转化。Soete 等在43℃诱导培养速殖子，观察到包囊的形成，但包囊的绝对数量少于碱性条件下诱导形成的包囊数量。本研究发现，在预先热处理宿主细胞时，将37℃条件下培养的细胞放到相应高温环境中让培养基有一个缓慢的升温过程，有助于宿主细胞对热环境的适应。而直接用高温培养基处理宿主细胞，常导致宿主细胞的变性、脱壁、死亡，尤其用41℃和43℃高温培养基直接处理宿主细胞更为显著，这不利于热诱导实验的进行。
　　弓形虫体外培养和速殖子与缓殖子相互转化体系的建立，为探讨速殖子和缓殖子相互转化的机制、研究包囊形成的基础生物学及抗弓形虫药物筛选等提供了良好条件。虽然体外培养体系对探讨转化机制有很大帮助，但与体内的研究结果不完全相同。如在体外培养15h后缓殖子就已开始向速殖子转化，而用缓殖子灌胃小鼠18h 后，仍无功能性速殖子的形成。研究发现[1,10]，部分体外诱导转化的缓殖子能同时表达SAG1