小研细胞内氧化还原水平对大肠杆菌厌氧代谢产物的影响

　1 引 言
　　
　　吡啶核苷酸辅酶(NADP+、NAD+、NADH、NADPH )广泛存在于动物、植物和微生物的活细胞中，是目前已知的300多种脱氢酶的辅酶[1]，也是许多生物氧化还原电子传递链中的重要物质，在细胞生长增殖、信号1传递、基因调控、线粒体保护等方面起着重要的作用[2]。
　　除了生物医学相关的重要性以外[3,4]，其在工业催化转化中的重要作用也引起越来越多的重视。例如，Leonardo [5,6]阐述了NADH能够诱导乙醇脱氢酶的表达，从而对生产乙醇有利；Graef [7]的实验表明NADH/ NAD+高比例会抑制丙酮酸脱氢酶复合体的活性等。因此，细胞在生长过程中保持合适的氧化还原水平具有重要的生理意义，通过控制细胞内的氧化还原水平能够达到控制细胞代谢的目的。
　　大肠杆菌为兼性厌氧微生物，在有氧气存在时，其NADH可以通过呼吸链氧化从而达到氧化还原平衡；而在厌氧状态时，氧化还原的平衡只能通过代谢产物的分泌而达到平衡。因此在大肠杆菌厌氧发酵过程中的辅因子操作会对其代谢和产物分泌有复杂的影响[8,9]。本文通过多种方法较系统的研究了野生大肠杆菌、adhE敲除菌生长和代谢产物分泌与细胞内氧化还原水平的关系，这将为许多和大肠杆菌氧化还原相关的产品研究，尤其是琥珀酸等四碳化合物的发酵生产提供指导。
　　
　　2 实验材料和方法
　　
　　2.1 材料
　　2.1.1 菌株与质粒
　　本研究所使用的菌种和质粒如所示。
　　2.1.1 主要试剂与培养基
　　本文使用的试剂与原料均为分析纯以上。LB（Luria-Bertani）液体培养基，LB固体培养基，LBG 发酵培养基等参见文献[10]。
　　2.2 方法
　　2.2.1 甲酸脱氢酶活性测量方法
　　将厌氧培养的待测大肠杆菌细胞4000 rpm，4℃离心10 min,一般收集10-20 mL。将沉淀细胞用10 mL磷酸钠(pH=7.5)缓冲液重悬，冰上超声波破碎细胞。破碎的细胞在1500 rpm，4℃离心60 min，去除细胞碎片，即得待测液。具体测量的方法参见[13，14]。甲酸脱氢酶的活性单位定义为在30℃，pH7.5时每分钟氧化1.0mol的甲酸成为CO2所需的酶活。
　　2.2.2 NAD+与NADH 的测量方法
　　测量方法见文献[15]，[16]
　　2.2.3 菌体培养与发酵方法
　　发酵过程采用两阶段操作法。首先将菌种接种于LB培养基中，250 rpm震荡培养8小时后，按10%的比例接种发酵培养基。为维持发酵过程较高的CO2分压，实验中采用耐压、密闭的血浆瓶。发酵培养是在100 mL 的血浆瓶中进行，装液量为80 mL，发酵培养基预先放有适量碳酸镁来保持发酵过程的pH。接种后向血浆瓶中通入过滤除菌的CO2，CO2出口压力为0.05 Mpa，通气时间为2分钟。将血浆瓶在37℃，250 rpm震荡培养。发酵碳源的浓度均选用15 g L-1。
　　2.2.4 质粒的构建
　　甲酸脱氢酶表达质粒的构建引物：
　　上引5’-CCCCGGATCCAGGAGGAATTTAAAATGAAGATCGTTTTAGTCTTA -3’
　　下引：5’-CCCCGTCGACTTTATTTCTTATCGTGTTTACC-3’
　　2.2.5 基因敲除方法
　　具体基因敲除方法以及抗性标记的弹出，参见文献[11，12，13]。敲除乙醇脱氢酶所使用的引物由上海生工合成：上引：
　　5’-ATGGCTGTTACTAATGTCGCTGAACTTAACGCACTCGTAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC -3’；下引：
　　5’-CAGCTTTAGCCGGAGCAGCTTCTTTCTTCGCTGCAGTTTATGGGAATTAGCCATGGTCC -3’
　　验证引物：上引：5’-TTGCCAGACAGCGCTACTGA -3’；下引：5’-AACATTATCAGGAGAGCATT -3’
　　2.2.6 发酵产物的测定方法
　　采用HPLC测定，具体文献参见[17]
　　
　　3 实验结果与讨论
　　
　　3.1 不同氧化还原态底物对发酵产物的影响
为了考察不同氧化还原态的底物对大肠杆菌厌氧代谢产物分布的影响，对野生大肠杆菌以葡萄糖、葡萄糖酸和山梨糖醇为发酵碳源时厌氧状态下生长曲线和代谢产物的分布进行了测定。生长曲线显示虽然以山梨糖醇为碳源时菌种的稳定期延长，以葡萄糖酸为碳源时菌种的延迟期延长，但总体来说三种碳源对大肠杆菌的厌氧生长没有显著影响。在三种不同碳源条件下，仍使用两阶段发酵的方法，在所有碳源消耗以后，发酵液的组成情况如所示，可以看到还原度较高的碳源倾向产生更多的乙醇和琥珀酸，而减少乙酸的产生。
　　例如山梨糖醇发酵产生0.20 mol的琥珀酸和 0.77 mol的乙醇，而葡萄糖酸仅产生了0.10mol的琥珀酸和 0.23mol的乙醇。其它的影响还有葡萄糖酸发酵有利于乳酸的生产等。以上结果清楚的表明不同的发酵碳源对大肠杆菌发酵产物的组成有重大影响。为了了解这种变化和细胞内NADH，NAD+的关系，测量了这三种碳源厌氧状态发酵时NADH和NAD+的细胞内含量，结果如所示。虽然NADH，NAD+单独浓度变化的趋势不明显，但NADH/NAD+的变化趋势和不同碳源的还原状态以及发酵产物中乙酸和乙醇的比例的相关性非常明显。即高的NADH/NAD+比例会导致碳源流向还原性产物，例如乙醇和琥珀酸。虽然琥珀酸增加的不多，以上结果确实表明，可以通过控制细胞内的NADH来达到控制发酵产物的目的。
　　3.2 表达甲酸脱氢酶对大肠杆菌的氧化还原及代谢产物的影响
　　3.2.1 甲酸脱氢酶FDH 表达质粒的构建
　　由于在实际工作中不可能使用高成本的山梨糖醇，因此在活细胞内再生NADH是理想的选择。本实验选用细胞内表达假丝酵母甲酸脱氢酶来再生NADH。基因来自于pFDH1质粒，此质粒为将假丝酵母菌的fdh1基因克隆到载体质粒pBluescriptII SK+上而获得，由日本京都大学教授Yasuyoshi sakai惠赠[11]。由于没有合适的酶切位点，因此我们首先根据其发表的pFDH1质粒测序结果[11]设计以下的引物进行PCR扩增。用BamHI, SalI双酶切后首先和pUC18连接，然后酶切后和pET-28a(+)连接得到表达质粒pQZ8。此质粒还经过其它酶切验证（电泳图略）。
　　3.2.2 表达甲酸脱氢酶对野生大肠杆菌生长和发酵产物的影响
　　将构建成功的质粒pQZ8转入野生型大肠杆菌W1485中，仍旧依照前述的两步发酵的方法，以15 g L-1的葡萄糖为碳源进行发酵实验。在培养基中添加30 mg/L卡那霉素以使质粒稳定复制，并在转入厌氧条件后添加0.5 mMIPTG诱导质粒pQZ8表达甲酸脱氢酶。同时转化原质粒pET-28a(+)作为空白对照，条件同上。在IPTG诱导4小时和8小时后，分别离心收集菌体，进行甲酸脱氢酶活性的测量，具体分析结果所示。
　　清楚地表明了在IPTG 诱导下，质粒pQZ8 确实成功表达了假丝酵母的甲酸脱氢酶，但在实验中发现这种表达对菌体的生长是有影响的，表达甲酸脱氢酶后，菌体厌氧条件下对葡萄糖的消耗更快，菌体的比生长速率也相应的增加，这确实是一个有趣的现象。
　　因此，进一步考察了表达甲酸脱氢酶对大肠杆菌的代谢产物分布的影响，结果所示。
　　结合分析，表达甲酸脱氢酶消耗了发酵过程中产生的甲酸，因此甲酸在发酵结束后的含量非常低，而以山梨糖醇为碳源时却没有影响甲酸的产生。表达甲酸脱氢酶最显著的影响是增加了乙醇的得率到1.37 mol/mol葡萄糖，而乙酸和乙醇的产量均明显的下降。相比之下，以山梨糖醇为碳源时，虽然也有相似的趋势，但乙醇的绝对产量并没有增加。表达甲酸脱氢酶后发酵产品中乙醇与乙酸的比例与NADH与NAD+的比例的关系列于。W11485/pQZ8的乙醇与乙酸比例由1.05提高到了3.35，NADH与NAD+的比例也提高到了0.67，但NADH的绝对量却没有改变，因此确实是NADH和NAD+的比例影响代谢而不是NADH的绝对量。以上实验结果揭示了提高NADH和NAD+的比例能够使代谢流向还原度比较高的乙醇，而且其利用葡萄糖的速度并没有受到影响，反而更加迅速。但表达甲酸脱氢酶并没有对另外一个还原性代谢产物琥珀酸的产量产生明显的影响。因为似乎所增加的还原力优先供应乙醇的产生，而不会供应琥珀酸的产生。为了回答上述的问题，进一步构建了大肠杆菌合成乙醇的关键基因adhE（编码乙醇脱氢酶）敲除菌TUQ5（电泳图略）。
　　3.3 adhE 基因敲除菌中表达甲酸脱氢酶对代谢产物的影响
　　3.3.1 adhE 基因敲除菌中表达甲酸脱氢酶对代谢产物的影响
　　抗性删除株TUQ5在有氧条件下，生长情况和野生菌的生长曲线一致，没有任何明显的变化。在厌氧情况下的生长曲线和野生菌相比，延迟期增长，但最后达到最高生物量的时间和值都没有变化。在厌氧情况下的发酵结果显示，此菌株的乙醇产量降到非常低的0.050mol/mol葡萄糖，这说明乙醇脱氢酶的缺失确实成功消除乙醇的发酵产生。而除了不发酵产生乙醇外，其它发酵产物的变化均不很明显。表达甲酸脱氢酶后TUQ5菌株的生长受到了比较大的影响，结果如所示。具体表现为延迟期的进一步增长以及总体生长趋于平缓，最后的生物量也受到了很大的影响。发酵产物的组成分析如所示，除乳酸和乙醇的得率有不同程度的上升以外，其它发酵副产物得率均下降。甲酸在发酵液中仍旧有比较高的残留，这说明甲酸脱氢酶并没有发挥很大的作用。这非常可能是因为菌株的生长受到了比较大的影响后的复杂调节机制在起作用，因为细胞这时不能保持氧化还原的平衡。但琥珀酸的产量也没有提高，这是比较难以解释的现象，即为何多余的还原力不能够流向和乙醇一样还原度比较高的琥珀酸呢？此问题比较复杂，但有可能是因为琥珀酸和其它有机酸分泌的调控机制不同所导致的。
　　
　　4 结论
　　
　　（1）以葡萄糖，葡萄糖酸和山梨糖醇为发酵碳源时厌氧状态下的大肠杆菌的生长和代谢产物的分布进行了测定。结合通过NADH，NAD+的测量表明NADH/NAD+的比例确实可以改变大肠杆菌的发酵产物的分布。高还原性的发酵碳源有利于还原性产物乙醇的发酵，而琥珀酸的得率有微量的上升。
　　（2）通过细胞内表达假丝酵母甲酸脱氢酶可以提高NADH/NAD+的比例，野生大肠杆菌中表达甲酸脱氢酶后，菌体对葡萄糖的消耗更快，消耗了发酵过程中产生的甲酸，因此甲酸在发酵结束后的含量非常低。而乙醇的得率达到了很高的水平，琥珀酸的得率变化很小。
　　（3）在adhE基因敲除菌TUQ5中表达甲酸脱氢酶后TUQ5菌株的生长受到了比较大的影响，除乳酸和乙醇得率有不同程度的上升以外，其它发酵副产物均下降。