STEAP4抗体干预对人前体脂肪细胞内活性氧、线粒体膜电位的影响
0 引言人 STEAP4 基因，是本研究小组2004 年应用抑制性差减杂交技术筛选肥胖与正常人网膜脂肪组织中差异表达基因（differentially expressive genes）时，获得并克隆到的一条肥胖相关全长新基因[1]。前期研究发现，STEAP4 定位于细胞膜，高表达于人脂肪组织，肥胖者脂肪组织中该基因表达显著下调，人前体脂肪细胞中该基因过表达能显著提高成熟脂肪细胞胰岛素刺激下的葡萄糖摄取率[2]，提示 STEAP4 基因的功能与肥胖、胰岛素敏感性均密切相关，但其确切机制并不清楚。由于研究已证实STEAP4 是一种跨膜蛋白[3]，目前胰岛素抵抗发生的机理主要有游离脂肪酸学说、内分泌和炎症学说、线粒体功能障碍学说、氧化应激学说、内质网应激学说，其中以线粒体功能障碍学说近年来备受关注[4-5]，因此本文应用STEAP4 抗体干预人脂肪前体细胞，以活性氧（reactive oxygen species，ROS）、线粒体膜电位为线粒体功能指标，初步探讨STEAP4 与线粒体功能之间的关系，为深入分析STEAP4影响胰岛素敏感性的机制提供线索。
1 材料和方法
1.1 材料
人前体脂肪细胞株、左旋赖氨酸为美国Sciencell 公司产品，DMEM 培养基、10%胎牛血清为美国Gibco 公司产品，STEAP4 抗体为美国LifeSpan Biosciences 公司产品，台盼兰、H2-DCFDA probe 为美国Sigma 公司产品，激光共聚焦仪器为德国Zeiss 公司产品，MitoTracker Red 购自美国Invitrogen 公司。
1.2 方法
1.2.1 人前体脂肪细胞的培养
人前体脂肪细胞株，采用DMEM 培养基加10%胎牛血清在37℃、5%CO2 培养箱中培养，每两天换一次液；采用0.05%胰酶、0.01%EDTA 进行细胞传代。盖薄片泡酸过夜、双蒸水洗净后浸泡于75%酒精中备用，酒精灯烧过后放在六孔板中，加入1:500 稀释的左旋赖氨酸包被过夜，待细胞长至80%融合度时用于铺板。
1.2.2 细胞活性实验
为排除血清对抗体的影响，本研究在无血清培养基基础上评价STEAP4 抗体的作用。设立对照组（抗体溶解液）与抗体干预组，抗体干预组则在浓度0.5mg/ml 基础上按不同比例稀释，设立1:1000 组、1:500 组、1:250 组、1:50 组。在细胞生长至60%时首先行无血清饥饿24 小时，继之再以抗体溶解液（对照组）、不同浓度抗体（抗体组）孵育24h。消化细胞，1500rpm 离心8 分钟。离心后应用0.2%台盼兰染色，并行细胞计数。重复三次独立实验，计算平均值和标准差。
1.2.3 人前体脂肪细胞活性氧（ROS）检测
50μg H2-DCFDA probe，加入102.61μl DMSO 溶解，至终浓度1mM。取适量1mMH2-DCFDA 贮备液加入无血清DMEM 中，配制H2-DCFDA 工作液，至终浓度5μM。去除细胞培养液，无血清DMEM 洗1 次，加入预热的H2-DCFDA 工作液，37℃孵育30 min。去除H2-DCFDA 染色工作液，用预温的PBS 洗涤3 次。激光共聚焦拍照并计算荧光强度，荧光强度强弱代表细胞内活性氧产生的多少。
1.2.4 人前体脂肪细胞线粒体膜电位的检测
50μg MitoTracker Red，加入94.07μl DMSO 溶解，分装成10μl/管，-20℃冻存备用，终浓度1mM。取适量1mM MitoTracker Red 贮备液加入无血清DMEM中，配制MitoTracker Red工作液，至终浓度150 nM。去除细胞培养液，无血清DMEM 洗1 次，加入预热的MitoTrackerRed 工作液，37℃孵育30 min。去除MitoTracker Red 染色工作液，用预温的PBS 洗涤3 次。激光共聚焦拍照并计算荧光强度，荧光强度强弱代表膜电位强度高低。
1.2.5 统计学方法
应用 SPSS11.5 软件进行统计学分析, 数据以均数±标准差（?x ± s）表示，多组间均数比较采用方差分析F 检验后，进一步采用q 检验进行组间两两比较；两样本均数之间的比较，经方差齐性分析F 检验后，选择t 或t'检验，p<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 STEAP4 抗体干预对人前体脂肪细胞活性的影响
STEAP4 抗体浓度0.5mg/ml 按不同倍数稀释后干预人前体脂肪细胞，由可见1:250稀释组、1:50 稀释组人前体脂肪细胞的细胞活性显著降低（P<0.05），提示0.5mg/ml、最低1:250 稀释的STEAP4 抗体浓度能影响人前体脂肪细胞的细胞活性，可选择该抗体干预浓度进一步评估STEAP4 抗体干预对人前体脂肪细胞内活性氧、线粒体膜电位的影响。
2.2 STEAP4 抗体干预对人前体脂肪细胞活性氧（ROS）含量的影响
活性氧是细胞代谢过程中产生的、具有氧化作用的副产物，主要来源线粒体。本研究以STEAP4 抗体（0.5mg/ml）1:250 稀释后干预人前体脂肪细胞，采用荧光探针方法定量、定性分析人前体脂肪细胞内活性氧的变化，结果发现STEAP4 抗体干预可显著增加细胞内活性氧的产生，与无血清诱导组比较细胞内ROS 含量显著升高（P<0.05）。
2.3 STEAP4 抗体干预对人前体脂肪细胞线粒体膜电位的影响
线粒体膜电位是指线粒体内膜两侧质子及其他离子浓度不对称而产生的跨膜电位差。通常采用激光共聚焦显微镜扫描与测量荧光染料染色后亲脂性离子在细胞内、外的分布来反映细胞膜电位。本研究以STEAP4 抗体（0.5mg/ml）1:250 稀释后干预人前体脂肪细胞，采用荧光探针方法定量、定性分析人前体脂肪细胞内线粒体膜电位的变化，结果发现STEAP4抗体干预可显著降低细胞内的线粒体膜电位，与无血清诱导组比较细胞内线粒体膜电位水平显著下降（P<0.05）。
细胞培养至60%密度时，有血清培养细胞设为正常组，孵育48 小时；无血清诱导组、抗体干预组则在无血清培养基饥饿24 小时后分别加入抗体溶解液、STEAP4 抗体（0.5mg/ml，1:250 稀释）继续孵育24 小时，经荧光分子探针H2DCFDA 染色后，采用激光共聚焦测定荧光强度，重复三次独立实验，并计算荧光强度平均值。* P<0.05。
细胞培养至60%密度时，有血清培养细胞设为正常组，孵育48 小时；无血清诱导组、抗体干预组则在无血清培养基饥饿24 小时后分别加入抗体溶解液、STEAP4 抗体（0.5mg/ml，1:250 稀释）继续孵育24 小时，经荧光分子探针MitoTracker Red 染色后，采用激光共聚焦测定荧光强度，重复三次独立实验，并计算荧光强度平均值。* P<0.05。
3 讨论
人 STEAP4 基因是新发现的一条肥胖相关全长新基因。研究发现，STEAP4 定位于细胞膜[2]；生物信息学分析显示，STEAP4 蛋白存在血红素蛋白、辅酶II 氧化还原酶、三铁还原酶等结构域，提示STEAP4 抗体干预可能影响其与铁离子的结合、电子转运、能量代谢等过程而发挥作用。由于先前研究发现，人脂肪细胞中STEAP4 基因的表达受肿瘤坏死因子alpha（tumor necrosis factor-alph，TNF-α）、白细胞介素6（interleukin 6，IL-6）、瘦素（Leptin）等炎症因子调控，同时该基因过表达（over-expression）能显著提高成熟脂肪细胞胰岛素刺激下的葡萄糖摄取率[3]，提示STEAP4 基因与胰岛素敏感性的调节有关，但STEAP4 影响胰岛素敏感性的机制并不十分清楚，因此本研究应用STEAP4 抗体进行直接干预，以胰岛素抵抗发生机制的线粒体功能障碍学说为线索，初步分析STEAP4 抗体干预对人前体脂肪细胞线粒体功能的影响。
ROS 与线粒体膜电位是评价线粒体功能的两个常用指标。已知，细胞内ROS 含量90%产生自线粒体，线粒体功能受损时ROS 显著增加[6-7]，同时线粒体因其DNA 不受组蛋白保护、膜脂质和基质中脂肪酸易于被ROS 氧化、产生的ROS 靠近线粒体内膜，因此也是ROS极易攻击的主要靶标[6-7]。线粒体膜电位则在维持线粒体正常生理功能中发挥重要作用，由于文献报道线粒体膜电位降低可抑制线粒体融合、破坏线粒体扁平网状结构、诱导线粒体破碎和分裂，不但引发线粒体形态异常，而且也导致线粒体功能障碍[8-9]，因此线粒体膜电位的检测能够反映线粒体的功能状态。本研究以ROS、线粒体膜电位为评估指标，初步观察STEAP4 抗体干预对人前体脂肪细胞线粒体功能的影响，结果发现STEAP4 抗体干预后人前体脂肪细胞内ROS 含量显著最高、线粒体膜电位显著降低，因而可初步推断STEAP4 影响胰岛素敏感性的机制可能涉及线粒体功能的变化。
由于线粒体功能障碍学说认为，其导致胰岛素抵抗的机制主要与线粒体损伤后脂肪酸代谢障碍、胞内脂质代谢物增加、激活胰岛素受体底物1（Insulin Receptor Substrate 1，IRS1）丝氨酸/苏氨酸磷酸化、阻碍IRS1 酪氨酸磷酸化、进而抑制PI3K（phosphatidyl inositol3-kinase，PI3K）活性、最终导致胰岛素抵抗有关[4-5]，因此进一步围绕IRS1-PI3K 信号途径，开展STEAP4 影响胰岛素敏感性的功能研究将十分必要。
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