同工酶分析新疆狗牙根的遗传多样性
0 引言狗牙根[1]为多年生草本植物，世界上分布极广，具有丰富的遗传变异，是宝贵的草坪草种质资源。新疆狗牙根具有较强的抗寒性、抗旱性、耐盐性、抗热性、抗病虫害等特性[2]，因此在草坪生产中受到广泛重视。从二十世纪八十年代起，新疆农业大学研究人员对新疆狗牙根资源状况与分布特点、生物学特性、品种选育、建坪技术、种子生产技术等方面进行了研究[2],成功地培育了3 个形态上有明显差异的狗牙根新品种即新农1 号狗牙根[3]、喀什狗牙根[4]和新农2 号狗牙根,目前还选育出了4 份表现比较优良的狗牙根品系。为了更好利用资源需对其遗传多样性进行研究。
由于杂交、多倍体、无融合生殖等，使通过形态特征检测狗牙根种质资源遗传多样性具有一定的困难。同工酶作为一种稳定的遗传标记，是遗传多样性分析的一种经济有效的方法。Dabo 等用PAGE 凝胶电泳法检测出不同狗牙根品系的同工酶差异性[5]。刘建秀等用酯酶同工酶[6]对华东地区野生狗牙根的遗传变异进行研究，发现居群内变异大于居群间变异。王赞，毛凯等[7]对攀西地区野生狗牙根资源进行形态和同工酶水平研究，表明不同居群蛋白质图谱与地理分布和生境条件有一定关系，过氧化物酶同工酶作为遗传标下单位亲缘关系和遗传多样性研究。对于新疆狗牙根的研究多侧重于外部形态方面[2]。本研究以这7 份新疆狗牙根为试验材料，通过过氧化物酶、酯酶、酸性磷酸酯酶、超氧化物歧化酶等同工酶分析，对其遗传多样性进行研究,为新疆狗牙根资源的开发及新品种的选育提供基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
7 份供试材料分别为:新疆农业大学草业与环境科学学院选育的新农1 号狗牙根、喀什狗牙根和新农2 号狗牙根及新品系新疆狗牙根C2、新疆狗牙根C3、新疆狗牙根C4、新疆狗牙根C5。
1.2 试验方法
同工酶电泳参照郭尧君[8]等的方法, 同工酶染色参照何忠效 [9]、王中仁[10]等的方法并做了相应的改动。
随机抽取直立茎顶部倒数第三片叶片，每个小区取样数10 个。每0.2 克叶片约加700u1提取液（ddH2O），冰浴研磨,9000r/min, 4℃离心机中离心15min，取上清，加入等体积的上样缓冲液(20%蔗糖+0.1 溴酚篮)并混匀，置于4℃条件下保存备用。
四种同工酶电泳均采用不连续性垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶的浓度为10%，浓缩胶的浓度为4%。其电极缓冲液都为Tris-甘氨酸缓冲系统(Tris)，电泳时上样量均为30u1。160V 电压下恒压电泳约2.5h，当前沿指示剂距胶板底部约lcm 时停止电泳，之后进行染色。
1.3 数据处理
将酶谱中的酶带按照其特征和相对最大迁移率命名、分区，并将具有多态性的谱带有带的量化为1，无带的量化为0，计算新疆狗牙根材料遗传相似系数，同时对供试材料进行酶谱带数的统计及多态性研究。采用类平均法（unweighted pair group method arithmetic average）对相似系数矩阵进行聚类分析，聚类结果中的树状图是根据欧式距离进行分类分析。所有数据统计由DPS v2.00 统计软件完成。
各酶条带的最大迁移率(Rf):
Rf=X2/X1
式中 X2 - 染色后酶条带的迁移距离；
X1 - 染色后溴酚蓝指示剂的迁移距离。
2 结果与分析
2.1 同工酶多态性分析
供试材料过氧化物酶、酯酶、酸性磷酸酯酶以及超氧化物歧化酶四种同工酶电泳酶谱显示出较为丰富的多态性差异。四种同工酶中酯酶产生的总条带数最多，而且产生的多态性条带数也最多，多态性百分比与其余同工酶相比也是最大； 过氧化物酶比酸性磷酸酯酶的总条带数多1 条，但两者的多态性条带数相同；超氧化物歧化酶产生的总条带数和多态性条带数均最少。因此可知，四种同工酶的多态性大小为:酯酶>酸性磷酸酯酶>过氧化物酶>超氧化物歧化酶。
2.2 同工酶酶谱特征分析
2.2.1 过氧化物酶（POD）同工酶酶谱结构及特征分析
电泳检测表明，7 份新疆狗牙根材料的 POD 同工酶酶谱可分为A、B 两个区(由阴极到阳极),A 区每份材料都有二条强带，最大迁移率分别为3.64%、7.27%；其中新疆狗牙根C2、新疆狗牙根C3、新疆狗牙根C4、新疆狗牙根C5、喀什狗牙根还有一条弱带或中度带，且弱带或中度带的最大迁移率均小于强带； B 区除新农1 号狗牙根有二条带，其余材料均有三条带。B 区，迁移率12.7%位点的强带是新农2 号狗牙根过氧化物酶的特征带之一;迁移率19.1%位点的谱带是新疆狗牙根C2 过氧化物酶的特征带之一。
2.2.2 酯酶（EST）同工酶酶谱结构及特征分析
从看，酶带可明显分为A、 B、C三个区(由阴极到阳极)。在A区(迁移率0.0%-12.73%)中只新疆狗牙根C2、新疆狗牙根C3 分别在迁移率6.36%和12.73%两位点处呈现二条谱带，其他材料仅在迁移率12.73%有一条谱带；B 区（迁移率20.0%-29.1%）中，除新疆狗牙根C3、新疆狗牙根C5 外，其余材料均有一条带，迁移率25.45%位点的谱带是新农2 号狗牙根酯酶的特征带之一；迁移率29.10%位点的谱带是新疆狗牙根C2 酯酶的特征带之一；C 区（迁移率32.73%-38.18%）中，迁移率32.73%位点的谱带是新疆狗牙根C4 酯酶的特征带之一。
2.2.3 酸性磷酸酯酶同工酶酶谱结构及特征分析
电泳检测表明，7 份新疆狗牙根材料的酸性磷酸酯酶同工酶酶谱可分为A、B 两个区(由阴极到阳极)。 A 区在迁移率7.27%处，仅新农2 号狗牙根、新疆狗牙根C2 有一条带。B 区（迁移率20.0%-31.82%）中，迁移率25.45%位点的谱带是新疆狗牙根C4 酸性磷酸酯酶的特征带之一。喀什狗牙根和新疆狗牙根C2 的最大迁移率明显较小，分别为2.7%，7.3%;其余材料最大迁移率均在20%-31.8%之间。
2.2.4 超氧化物歧化酶（SOD）同工酶酶谱结构及特征分析
电泳检测表明，7 份新疆狗牙根材料的酸性磷酸酯酶同工酶酶谱可分为A、B、C三个区(由阴极到阳极)。在A 区(迁移率0.0%-6.36%)中，有一条带，是新农二号狗牙根超氧化物歧化酶的特征带之一；在B 区(迁移率21.82%-34.55%)中,新疆狗牙根C4、新疆狗牙根C5、喀什狗牙根有三条带，其余材料均有二条带。在C 区中，在迁移率为60.0%处，只有新疆狗牙根C5 和新农1 号狗牙根有一条带。
从以上分析上看，7 份新疆狗牙根材料的四种同工酶谱在酶带数量(见表2)、迁移率和表达量上表现出差异，其中以过氧化物酶谱带数最为丰富，各材料间在同工酶谱带上有较大差别，显示了其遗传上的多样性。
2.3 新疆狗牙根材料同工酶谱带的聚类分析
基于四种同工酶酶谱相似系数的聚类结果，在遗传相似距离2.21 处将7 份新疆狗牙根材料分成四类：新农1 号狗牙根、新农2 号狗牙根各为一类，新疆狗牙根C2、新疆狗牙根C4 和喀什狗牙根聚为一类；新疆狗牙根C3 和新疆狗牙根C5 聚为一类。
新疆狗牙根C2与新疆狗牙根C4同工酶酶谱相似性强，说明这两份材料的遗传差异较小，亲缘关系较近；新疆狗牙根C3 与新疆狗牙根C5 同工酶酶谱相似性强，说明这两份材料的遗传差异较小，亲缘关系较近。新农1 号狗牙根、新农2 号狗牙根与其他供试狗牙根材料同工酶酶谱差异较大，分别单独为一类，说明与其他供试狗牙根的遗传差异较大，亲缘关系较远。
3 讨论
形态标记的遗传表达有时不太稳定，易受环境、生育期及基因显隐性的影响；同工酶是基因表达的产物，与形态性状相比，受环境的影响较小，结果易于比较，对7 份新疆狗牙根材料生物学特性、坪用性以及环境适应性（越夏、抗病虫害、越冬率）等方面已作了相关试验研究[12]。新疆狗牙根C3 和新农1 号狗牙根形态相似性强，但谱型差异较大，说明形态与同工酶谱型并无绝对相关性。新疆狗牙根C4 和喀什狗牙根形态相似性强，同工酶酶谱型较相似，表现极强同源性。新疆狗牙根C5 和新疆狗牙根C3 外形相差较大，但同工酶酶谱型相似性强，说明尽管生态适应使狗牙根的外型发生变化，但还未涉及到控制蛋白质合成的基因位点发生变化。供试狗牙根广泛分布于新疆南北疆平原绿洲、喀什、伊犁、阿克苏、哈密、吐鲁番、克勒玛依、塔城、昌吉、乌鲁木齐等地区[2]，形态相差较大，谱型具有多型性，但基本谱型相同，说明其遗传变异是等位基因差异造成的[13]。
同工酶是基因的产物，受植物生育阶段、环境条件等的影响，反映出来的遗传多样性的稳定性和准确性较DNA 水平的多态性逊色一些[11]，终归只是基因的表现型而不是基因型，所以还不能真正从基因水平检测遗传多样性。因此，在用同工酶检测植物遗传多样性时，还应结合DNA 分子标记(如RAPD, RFLP, AFLP 等等)共同进行，才能更完整的反映供试材料的遗传多样性。
4 结论
利用过氧化物酶同工酶(POD)、酯酶同工酶(EST)、超氧化物歧化酶(SOD) 、酸性磷酸酯酶对7 份新疆狗牙根材料遗传多样性进行检测，结果表明：供试材料同工酶多样性程度高，在欧氏距离2.21 处将7 份新疆狗牙根材料分成四类：第Ⅰ类为新农2 号狗牙根、第Ⅱ类包括新疆狗牙根C2、新疆狗牙根C4、喀什狗牙根；第Ⅲ类包括新疆狗牙根C3、新疆狗牙根C5；第Ⅳ类为新农1 号狗牙根。四种酶中，酯酶同工酶(EST)的多态性最高，可良好区分新疆狗牙根种内不同生态型。
参考文献
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