探讨现代DNA分子标记技术研究进展

　1 引言
　　
　　随着分子生物学尤其是分子克隆技术和DNA 测序技术发展，越来越多的基因信息被获得，随之而来的是越来越新的分子标记技术的应运而生，这些标记技术使标记的结果也越来越准确，特别是它们和基因，甚至某种特定的功能或性状联系在一起，使其在研究中的应用日益广泛，以下主要介绍两大类分子标记技术。
　　
　　2 以 EST（expressed sequence tag）为基础的分子标记技术
　　
　　EST 是从一个随机选择的cDNA 克隆进行5’端和3’端单一次测序获得的短的cDNA 部分序列,代表一个完整基因的一小部分,在数据库中其长度一般从20 到7000bp 不等,平均长度为360 ±120bp 。1993 年美国国家生物技术信息中心（National center of Biotechnologyinformation, NCBI ）建立了专门的EST 数据库dbEST(data base of EST)来收集和保存EST数据，截止到2008 年12 月已经收集到EST 数据库59183239 个，其中EST 最多的是人类（human,8163896）、小鼠（mouse,4850605）和玉米(maize,2018526) [1]，这些大量的数据极大的方便和加快了人们在生命科学领域的研究，为开发EST 分子标记奠定了基础。
　　2.1 EST-SSR 标记技术
　　EST-SSR 是建立在传统的SSR （ Simple SequenceRepeat）标记技术上的一种新型的分子标记技术，SSR 是指1-6 个碱基长度的核苷酸单位以多次重复串联排列在基因组上的一段序列，传统的SSR 标记的开发过程如右。
　　在整个过成中文库的构建和测序是极为繁琐和费时的，而大量的EST的出现就避免了文库的构建和测序，因此EST-SSR标记技术被大家广泛的应用。EST-SSR 的难点是EST 数据的前期处理和引物对的设计，现在网上出现了很多软件和网站可以识别EST 中的SSR 位点，甚至可以直接设计出可用的引物,这里只介绍两个作者认为比较方便的软件，第一个是SSR Locator （Carlos et al 2008），这个软件不仅能从EST 中找到SSR 位点并设计锚定引物,而且也能从基因组DNA 中找到SSR 位点，并设计出相关引物[2]，另外一个就是SSRHunter，它是李强等利用Visual Basic 语言开发出的本地化的SSR 位点搜索软件，SSRHunter 软件能够较出色地完成SSR 位点的搜算、自动序列预处理、常规的序列整理和序列变换等功能，其结果的输出方式也比较方便，而且这个软件操作界面比较友好，很适合初学者使用[3]。目前EST-SSR 技术在国内外获得广泛的应用，弥补了传统的SSR 标记技术的费用高和繁琐等缺点，而且随着研究的深入这种标记越来越倾向和有功能的基因联系起来，如Senthilvel 等对珍珠粟（pearl millet）进行EST-SSR 标记，获得大量跟珍珠粟功能基因相关的有价值的SSR 标记[4]。Choudharv 等通过EST-SSR 对鹰嘴豆（chickpea）不同种属间等位基因变异进行了分析，初步了解了鹰嘴豆不同种属间相关变异规律[5]。Castillo 等通过EST-SSR 分清了大麦（barley）与其属内其它种类大麦以及和小麦之间的亲缘关系[6]。Blanco 等人通过EST-SSR 建立了一种针对杂交抗白粉病小麦的分子标记[14]。相对来说国内最近几年这方面的研究比较少一些，最近两年华中农业大学张献龙等人把其应用于棉花上，对棉花的一些数量性状基因进行了标记与分析[7]。
　　2.2 EST-PCR 标记技术
　　EST-PCR 是根据EST 序列设计引物对特定的区域进扩增，这样就可能揭示出不同材料在编码区、非编码区及调控区序列的差异。EST-PCR 是否具有多态性是此标记成功的关键，一般情况下其在体内的多态性较低，一般情况下通过以下几种方法增加其多态性：
　　（1）在选择标记区段时应该尽量靠近3’端或者5’端非编码区，这些区域的变异性比较高，容易产生多态性[7]。
　　（2）对那些无多态性的EST-PCR 用不同的限制性内切酶消化，而后再进行电泳分析，这样一来那些大小相同的扩增片段由于内部序列的差异就在电泳图上呈现出多态性。这种方法在对日本柳杉和洋葱的EST-PCR 标记中获得证实[9、10]。
　　(3) 改进扩增产物的分析方法。比如使用分辨率较高的聚丙烯酰胺凝胶电泳或者变性梯度凝胶电泳进行分析，特别是后者对大小相同序列内部存在差异的核酸片段有很好的分离作用。
　　2.3 EST-RFLP 标记技术
　　EST-RFLP 的基本原理和传统的RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphisma 限制性片段长度多态性)基本相同，唯一不同的是所用的探针是cDNA，也即是EST 本身，其多态性的产生依赖于探针和不同限制性内切酶的组合。这种分子标记技术经常用来在染色体上定位某种特定性状的基因或者绘制遗传图谱，如Riaz 等人用这种技术把一种抗病基因定位于一种岩生葡萄的染色体上[11]，Schwarz 等人利用此技术构建了大麦染色体的物理图谱[12]。
　　2.4 EST-AFLP 标记技术
　　EST-AFLP 的操作过程如右下图。此技术结合了AFLP技术和RT-PCR 技术的优点，最大的特点是特异性强，对低丰度的表达产物也比较敏感，并且在转录产物高度表达时，扩增条带的强度还能准确反应基因间表达量的差异。Qin[16] 等(2001)开发了 GenEST 软件， 可以利用 EST 数据对DNA 进行 AFLP 操作， 有效地实现EST 数据与 cDNA-AFLP 的信息双向连接和转化。他们将感染了马铃薯胞囊线虫的材料根据感染程度分5 个阶段取材，用 cDNA-AFLP 方法结合256 对引物进行分析，共获得了8200 个TDF(transcripts-derived fragment)。Esposito 等人通过EST-AFLP 技术分析了抗病性马铃薯和敏感性马铃薯在接种病原菌后机体内基因表达的差异性，并建立了细菌马铃薯相互作用的分子标记[13]。Sun YD 等人利用黄瓜的
　　EST-AFLP 标记片段克隆了黄瓜的CsEXP10 基因[15]。
　　2.5 EST-SNP 标记技术
　　SNP（单核苷酸多态性，Single Nucleotide Polymorphisms）是指在基因组上单个核苷酸的变异,包括置换、颠换、缺失和插入。从理论上来看每一个SNP 位点都可以有4 种不同的变异形式,但实际上发生的只有两种,即转换和颠换,二者之比为2 :1。SNP 在CG 序列上出现最为频繁,而且多是C 转换为T ,原因是CG 中的C 常为甲基化的,自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。一般而言,SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP ,人类基因组上的SNP 总量大概是3 ×106 个。而 EST-SNP 可以通过比对多序列簇的EST 以获取序列的多态性信息，包括候选的SNP 位点。表1 中列举了几个常用的软件或者数据库，它们能从EST 序列中找到SNP 位点，进而建立EST-SNP 标记。除了这些软件之外Franncisco 和 Leslie 等人根据SNP 的特点分别建立了一种在大量EST 序列中搜寻SNP 位点的方法[17,18],这两种方法各有有点，前者能够大通量的处理EST 序列，从中找到SNP 位点，而后者则能够迅速准确的找到SNP 位点，但是只能逐条处理序列。所有这些软件或者方法的基本原理大致相同，都是首先类聚同源序列，而后再对这些同源序列进行比对。值得注意的是，EST-SNP 多态性有些可能只是测序时碱基响应(base call)的问题，或cDNA 反转录和大肠杆菌聚合酶复制过程产生的错配，所以筛选这些SNP 时应注意以下几点：
　　(1)一些聚类的重叠区域质量比较低， 往往发生连续的不配对， 这些一般确认率比较低， 所以应尽量选择两侧有一定数量严格配对(perfectmatch)的碱基的 SNP。
　　(2)由于使用聚类程序时，为了得到更高的比对分值往往需要在一条序列中加入空格，这些人为空格有可能造成低质量数据信号。为此， Picoult-Newberg 等(1999)建议， 甚至可不考虑这些可能是插入或缺失的SNP 位点而只关注替换类型[19]。
　　(3)由于每个碱基响应质量与其所在的位置相关，如测序前区段的序列质量往往较低，因此可选择序列质量比较高的前100 个碱基以后的 SNP。
　　(4)由于同一个碱基位置上随机发生两次错误的概率很低，为了得到高质量的 SNP，可以规定重叠区域必须有两条或两条以上的序列来佐证这个 SNP 位点。目前，在玉米、拟南芥、大麦、猪、三角帆蚌、苹果等物种上都有EST-SNP 的研究报道[20-25]。
　　
　　3 以基因序列特点为基础的分子标记
　　
　　随着我们对各物种基因组研究的深入，尤其是对一些功能基因的了解，我们对这些基因序列的特点及变异程度的把握也越来越清楚了，如外显子序列保守性比较强，内含子区域的保守性相对来说差一些，在内含子和外显子之间的剪接区域保守性也比较小等。根据这些特性人们开发了一些新的分子标记技术。这些标记技术都是尽可能的向功能型分子标记技术靠拢，试图将标记位点与基因序列联系起来，以达到了解其功能型的目的，下面简要介绍下这些分子标记技术。
　　3.1 IFLP 标记技术
　　IFLP(Intron Fragment Length Polymorphism )标记技术是Slabaugh 等人为了标记向日葵中抗霜霉病基因簇而建立的的一种分子标记技术。它基本原理是针对特定基因，在内含子两侧设计引物扩增目标内含子，从而达到对特定基因定位的目的。如Slabaugh 等人通过这个标记，可以快速准确地在野生型向日葵中筛选抗霜霉病的植株[34]。
　　3.2 SSCP-SNP 标记技术
　　SSCP-SNP(Single-Strand Conformational Polymorphism-Single Nucleotide Polymorphisms)的操作过程类似于IFLP，都是针对内含子两侧的序列进行扩增，但是用此种标记技术时需要以大量的基因序列和EST 序列为基础，这样才能设计出多态性高的引物，进行多肽性扩增。由于其前提条件要求比较高，这种标记技术目前还没有大规模的应用，目前报道的只有Bertin 等人在珍珠米（pearl millet）上应用过这种技术[35]。
　　3.3 SRAP 标记技术
　　SRAP ( Sequence- Related Amplified Polymorphism) 标记技术是由 Li 等在 2001 年提出的一种新的分子标记技术[26]。其基本原理是通过设计的引物对ORFs ( Open ReadingFrames ) 进行扩增, 上游引物对外显子进行特异扩增, 下游引物对内含子区域、启动子区域进行特异扩增。因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性。因其具有简便、稳定、在基因组中分布均匀的特点,已被广泛应用于番茄、黄瓜、烟草、甘蓝、樱桃和鱼类等多种生物[27-32]，对开展遗传图谱构建、基因定位与克隆、比较基因组学、cDNA指纹图谱和生物多样性等方面的研究是一个十分实用的工具。SRAP 标记成功的关键是合适的引物以及比较适宜的PCR 反应体系，要想的到丰富清晰的条带，必须在这两个因素上下工夫，即设计比较好的引物和摸索出比较适宜的PCR 反应体系。
　　3.4 ISAP 标记技术
　　ISAP(Intron Sequence Amplified Polymorphism)标记技术是陆才瑞等研究建立的一种新的分子标记技术，它是基于基因中内含子序列的功能型分子标记,试图将标记位点与基因序列联系起来以达到检测其功能型的目的。它利用内含子剪接位置的保守一致序列作为其引物的核心序列, 其上下游引物均为18bp,上下游引物间通过组合配对的方式作为扩增的引物对,对真核生物的基因序列进行扩增。已经有研究证明它是一种简单、可靠、具有较高多态性，并且和表达序列联系紧密的一种功能型分子标记[33]。
　　
　　4 讨论
　　
　　EST-RFLP 标记是共显性标记，可靠性高，在揭示植物的遗传信息和加速比较基因组研究等方面都起到了重要作用。但开发这类标记涉及到分子杂交和探针标记等繁琐的过程，技术要求较高，而且费用昂贵，现在已很少用。EST-AFLP 标记技术需要昂贵的实验设备和试剂，技术要求高，在一般实验室仍不易推广。EST-SNP 比较适合高通量的分析，而且它能够展示其它标记所不能检测到的隐藏的多态性，但是由于目前EST 序列的质量不是很高，当一个位点上碱基发生变化时，我们无法确定到底是由于测序的误差引起的还是自然存在的突变导致的，因此限制了这种技术的大规模应用。目前，在以EST 为基础的分子标记中应用的最多的是EST-SSR，它具有多态性高、呈共显性遗传、数量丰富、易于用PCR 检测和在基因组上分布均匀等特点，与传统的SSR(Single Sequence Repeat)相比，由于EST-SSR 来自转录区，与位置不确定的基因组SSR 相比具有更高的使用价值：当 EST-SSR 用于种质资源评价时， 它表现的是转录区的差异， 因而能够反映出“真实的遗传多样性”；在应用于分子标记辅助选择（marker assisted selection， MAS），且EST-SSR 位于控制目标性状的基因内部时，可以进行直接的等位基因选择；此外，由于EST-SSR 具有很高的可转移性，因此非常适用于比较作图研究和合并不同遗传图谱的锚定位点[36]。
　　SRAP 作为一种新型的分子标记，具有简便、稳定、中等产率、在基因组中分布均匀、测序方便、引物利用率高、成本较低等优点。此外，该技术主要是对ORFs（开放阅读框）进行扩增， 对基因相对较少的着丝粒附近和端粒的扩增较少。因此，结合可扩增这些区域的SSR 标记，便可获得覆盖全基因组的连锁图，但是SRAP 仅能触及60%的表达序列[37]。
　　IFLP、SSCP-SNP 和ISAP 标记技术都是对特定内含子区域进行扩增，间接地对特定基因进行定位。它们都缩短了标记位点和目标基因间的距离，具有重要的应用价值，但由于它不是直接对特定基因进行定位，准确性不是很高，加之其开发成本也比较高，所以在一定程度上限制了其应用,到目前为止只有SRAP 标记在多种物种中得到应用。
　　以上介绍的几种现代分子标记都是建立在研究对象的基因组序列或者是EST 序列比较清楚的基础上的，所以当我们遇到研究得较少的物种的时候，传统的分子标记RFLP、RAPD、AFLP、SSR 等在对这些对象的研究中，仍然起着重要的作用。
　　随着我们对基因组序列了解的不断深入，人们一定会趋向于建立这样一种分子标记技术，即一个标记位点代表一种特定的基因或者特定的性状，标记位点的强度代表这个特定基因表达量的强弱。如果这一目标实现，那么必将极大地推动多种物种尤其是植物的分子遗传连锁图的构建过程、重要农艺性状基因定位与克隆、转基因植物鉴定、动植物杂交育种过程和相关疾病的诊断过程等的发展。

　参考文献
　　[1] Dario Abel Palmieri, Velci Queiroz de Souza, Mauricio Marini Kopp
　　[2] Luciano Carlos da Maia, Dario Abel Palmieri, Velci Queiroz de Souza, Mauricio Marini Kopp, Fernando IrajáFélix de Carvalho, and Antonio Costa de Oliveira SSR Locator: Tool for Simple Sequence Repeat DiscoveryIntegrated with Primer Design and PCR Simulation Int J Plant Genomics. 2008; 2008: 412696.
　　[3] 李强; 万建民SSRHunter,一个本地化的SSR 位点搜索软件的开发 遗传 2005.10 vol 27, No.5 808-810
　　[4] Senthilvel S, Jayashree B, Mahalakshmi V, Sathish Kumar P, Nakka S, Nepolean T, Hash CT. Developmentand mapping of Simple Sequence Repeat markers for pearl millet from data mining of Expressed SequenceTags. Plant Biol. 2008 Nov 27;8(1):119.
　　[5] Choudhary S, Sethy NK, Shokeen B, Bhatia S Development of chickpea EST-SSR markers and analysis ofallelic variation across related species Theor Appl Genet. 2008 Nov 20 [Epub ahead of print]
　　[6] Castillo A, Budak H, Varshney RK, Dorado G, Graner A, Hernandez P Transferability and polymorphism ofbarley EST-SSR markers used for phylogenetic analysis in Hordeum chilense BMC Plant Biol. 2008 Sep28;8:97
　　[7] LIN Zhong-Xu; ZHANG Xian-long Genetic Analysis of Cotton Fiber Traits by Molecular Markers 棉花学报2008-S1-127
　　[8] Scott K D, Eggler P, Seaton G, et al. Analysis of SSRs derived from grape ESTs. Theoretical and AppliedGenetics, 2000, 100(5):723-726.
　　[9] MeCallum J, Leite D, PitherJoyee M, et al. Expressed sequence markers for genetic analysis of bulbonion(Alliun cepa L.). Theoreti-cal and Applied Genetics,2001,103:979-991.
　　[10]Iwata H, Ujino-lhara T, Yoshimura K, et al. Cleaved amplified polymorphic sequence markers in sugi andtheir locations on a linkage map. Theoretical and Applied Genetics,2001,103:881-895
　　[11]Riaz S, Krivanek AF, Xu K, Walker MA Refined mapping of the Pierce's disease resistance locus, PdR1, andSex on an extended genetic map of Vitis rupestris x V. arizonica Theor Appl Genet. 2006Nov;113(7):1317-29. Epub 2006 Sep 8
　　[12]Schwarz G, Miehalek W, Jahoor A, et al. Direct selection locus of expressed Sequence on a YAC clonerevealed praline-rich-like genes and BAKE-1 sequences physically linked to the complex Mla powderymildew resistance locus of barley (Hordeum vulgare L.). Plant Science, 2002, 163:307-311.
　　[13]Esposito N, Ovchinnikova OG, Barone A, Zoina A, Holst O, Evidente A Host and Non-Host Plant Responseto Bacterial Wilt in Potato: Role of the Lipopolysaccharide Isolated from Ralstonia solanacearum andMolecular Analysis of Plant-Pathogen Interaction Chem Biodivers. 2008 Dec 16;5(12):2662-2675.
　　[14]Blanco A, Gadaleta A, Cenci A, Carluccio AV, Abdelbacki AM, Simeone R Molecular mapping of the novelpowdery mildew resistance gene Pm36 introgressed from Triticum turgidum var. dicoccoides in durum wheat.Theor Appl Genet. 2008 Jun;117(1):135-42
　　[15]Sun YD, Zhang XG, Du XB, Su CG, Bi XH. Cloning and expression of cucumber CsEXP10 gene Zhi WuSheng Li Yu Fen Zi Sheng Wu Xue Xue Bao. 2006 Jun;32(3):375-80
　　[16]Qin L, Prins P, Jones J T, et al. a powerful bidirectional link between cDNA sequence data and geneexpression profiles generated by cDNA-AFLP. Nucleic Acids Res.2001,29(7):1616-1622.
　　[17]Leslie Picoult-Newberg, Trey E. Ideker, Mark G. Pohl et al Mining SNPs From EST Databases Genome Res.1999. 9: 167-174
　　[18]Francisco Jose Useche,Guang Gao et al High-Throughput Identification, Database Storge and Analysis ofSNPs in EST Sequences. Genome Informatics 12: 194-203 (2001)
　　[19]Picoult-Newberg L, Ideker TE, Pohl MG, et al. Mining SNPs from EST databases .Genome Research.1999,9:167-174.
　　[20]Kota R, Varshney R K, Thiel T, et al. Generation comparison of EST-derived SSRs and SNPs in barley(Hordeum, vulgare L.). Hereditas, 2001, 135:145-151.
　　[21]Barker G, Batley J, Sullivan H O, et al. Redundancy based detection of sequence Polymorphisms in expressedsequence tag data using auto SNP. Bioinformatics,2003,19:421-422.
　　[22]Rudd S, Sehoof H, Mayer K. PlantMarkers: a database of predicted molecular markers from Plants, NucleicAcids Research,2005,33:628-632.
　　[23]Sptter A, Hamann H, Müller S, Distl O. Effect of Polymorphisms in Four Candidate Genes for Fertility onLitter Size in a German Pig Line. Reprod Domest Anim. 2008 Dec 15.
　　[24]Hyriopsis cumingii Bai Z, Yin Y, Hu S, Wang G, Zhang X, Li J. Identification of Genes Involved in ImmuneResponse, Microsatellite, and SNP Markers from Expressed Sequence Tags Generated from Hemocytes ofFreshwater Pearl Mussel (Hyriopsis cumingii). Mar Biotechnol (NY). 2008 Nov 28
　　[25]Chagné D, Gasic K, Crowhurst RN, Han Y, Bassett HC et al Development of a set of SNP markers present inexpressed genes of the apple.Genomics. 2008 Nov;92(5):353-8. Epub 2008 Sep.
　　[26]Li G, Quiros C F. Sequence- related amplified polymorpgism SRAP a new marker systembased on a simplePCR reaction: its application to mapping and gene tagging in Brassica [J]. Theor Appl Genet, 2001, 103: 455-461.
　　[27]于拴仓, 柴敏, 姜立纲. 主要番茄品种的分子鉴别研究[J]. 农业生物科学, 2005, 21(5): 84- 89.
　　[28]李丽, 郑晓鹰, 柳李旺. 用 SRAP 标记分析黄瓜品种遗传多样性及鉴定品种[J]. 分子植物育种, 2006,4(5): 702- 708.
　　[29]刘建丰, 王志德, 刘艳华, 等. 应用 SRAP 标记研究烟草种质资源的遗传多样性[J]. 中国烟草科学,2007, 28(5): 49- 53.
　　[30]Zhang L, Zhao H, Liu F. Identification and analysis of asymmetric somatic hybrids between B. oleracea and B.nigra Fen Zi Xi Bao Sheng Wu Xue Bao. 2008 Aug;41(4):265-74.
　　[31]Zhang J, Fernando WG, Remphrey WR. Genetic Diversity and Structure of the Apiosporina morbosaPopulations on Prunus spp. Phytopathology. 2005 Aug;95(8):859-66
　　[32]Dinler G, Budak H. Analysis of expressed sequence tags (ESTs) from Agrostis species obtained usingsequence related amplified polymorphism. Biochem Genet. 2008 Oct;46(9-10):663-76. Epub 2008 Aug 26
　　[33]Lu CR, Yu SX, Yu JW, Fan SL, Song MZ, Wang W, Ma SJ. Development and appraisement of functionalmolecular marker: intron sequence amplified polymorphism (ISAP) Yi Chuan. 2008 Sep;30(9):1207-16.
　　[34]Slabaugh MB, Yu JK, Tang S, Heesacker A, Hu X, Lu G, Bidney D, Han F, Knapp SJ. Haplotyping andmapping a large cluster of downy mildew resistance gene candidates in sunflower using multilocus intronfragment length polymorphisms. Plant Biotechnol J. 2003 May;1(3):167-85.
　　[35]Bertin I, Zhu JH, Gale MD. SSCP-SNP in pearl millet--a new marker system for comparative genetics. TheorAppl Genet. 2005 May;110(8):1467-72. Epub 2005 Apr 5.
　　[36]Powell W, Gordon C Machray, Provan J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trends in PlantScience,1996,1(7):215-222.
　　[37]Varshney RK, Sigmund R, Borner A, Korzun V, Stein N, Sorrells ME, Langridge P, Graner A. Interspecifictransferability and comparative mapping of bafley EST-SSR makers in wheat, rye and rice. Plant Sci,2005,168: 195-202