探讨贝那普利对糖尿病鼠胰腺组织中TGF-β1和Smad3表达的影响
0 引言T2DM是多种因素导致的疾病，胰岛素抵抗和胰岛素分泌障碍是其发病的两个主要病理生理改变。但有人认为胰岛功能是更为重要的葡萄糖耐量决定因素，只要β细胞分泌足够量的胰岛素就不会发展为T2DM。胰岛素分泌减少主要是由于β细胞量的减少,还是β细胞本身的分泌缺陷所致,目前还没有定论。有证据表明内分泌胰腺存在RAS,而且其在多种T2DM大鼠模型中的表达都上调[1-3] 。过度激活的RAS一方面加剧了生理情况下对胰岛素合成和释放的抑制作用,另一方面也促进了内分泌胰腺的氧化应激、纤维化和胰淀素的沉积,而这些病理过程可同时影响β细胞量和其分泌功能[4]。本实验研究了TGF-β1 和Smad3在链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠胰腺织中的表达情况及胰腺局部RAS系统的激活,而且研究了贝那普利治疗后的情况。现报告如下。
1 材料和方法
1.1 实验动物与分组 雄性Wistar大鼠(甘肃省中医学院实验动物中心提供)28只,体重150-200g,随机分成3组: ①正常组(NC n=8)； ②糖尿病未干预组(DM n=10)；③糖尿病贝那普利干预组(BEN n=10)。
1.2 动物模型的建立 正常组采用常规饲料（12%蛋白质，5%脂肪，67%碳水化合物，16%其他）喂养。糖尿病未干预组和糖尿病贝那普利干预组采用高糖高脂饲料（10%猪油，20%蔗糖，2.5%胆固醇，67.5%常规饲料）连续喂养6周后，按Wistar大鼠体重,给予30mg/kg链脲佐菌素腹腔注射(链脲佐菌素购自Sigma公司,溶于0.1mol/L枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液, pH=4.0-5.0)。注射后72h取大鼠尾静脉血测定随机血糖≥16.7mmol/L,初步确定2型糖尿病模型建立。1周后再次测定各组动物空腹血糖和随机血糖。空腹血糖（禁食不禁水12小时）>11.1mmol/l，随机血糖≥16.7mmol/L，且有多饮、多尿（尿量>40ml/d）、多食现象的大鼠认为造模成功纳入实验（糖尿病未干预组8只大鼠，糖尿病贝那普利干预组8只大鼠）。正常组大鼠6周后腹腔注射等量柠檬酸钠缓冲液。
糖尿病大鼠自由进食水,不应用任何降糖药物。模型建立后第2天起,每日晨8时给予糖尿病贝那普利干预组贝那普利(诺华公司生产)1mg/kg灌胃（溶于生理盐水），每只大鼠的灌胃液的量为2.5ml。正常组和糖尿病未干预组两组予等量生理盐水灌胃。给药期间,各组大鼠自由饮食,均给予普通饲料喂养。
1.3 标本的收集、处理及试剂 （1）糖尿病模型建成后,每周测一次血糖和体重。给药8周后处死。禁食水12小时。10%水合氯醛400mg/kg腹腔注射麻醉各组大鼠。打开腹腔下腔静脉取血，离心，血浆冰冻保存测定胰岛素用。迅速取出胰腺,冰盐水冲洗,剪除包膜、周围组织，称取100mg胰腺组织液氮保存做组织匀浆测胰腺组织中的血管紧张素Ⅱ。剩余组织4%多聚甲醛固定、石蜡包埋留做免疫组化。（2）试剂:血管紧张素Ⅱ、胰岛素放免试剂盒均购于北京北方生物技术研究所。免疫组化采用常规免疫组化SABC检测方法。 一抗TGF-β1购于博士德公司, 工作浓度1∶50；一抗smad3购于Bioworld公司，工作浓度1∶100。二抗及显色剂均购于博士德公司。血糖采用美国强生血糖仪测定。
1.4 观察指标的测定（3）血管紧张素Ⅱ测定：每100mg胰腺组织加入2ml0.9%生理盐水，用匀浆器研磨，然后放入100℃水浴中煮沸10min，自然冷却后用恒温离心机4℃、3000rpm离心5min，取上清液- 20℃保存待测。血管紧张素Ⅱ测定按放免试剂盒说明书操作步骤进行。
（4）免疫组化方法：石蜡包埋的胰腺组织进行4μm厚的连续切片。二甲苯脱蜡,梯度酒精水化,3%过氧化氢室温孵育10min灭活内源性过氧化物酶,热修复抗原,每片加5%BSA封闭液，室温20min,分别滴加适当稀释的TGF-β1及Smad3抗体,4℃过夜。PBS洗2min×3次。再依此加入生物素化标记的羊抗兔IgG和显色剂工作液, 37℃20min,每步后均PBS冲洗,5min×3。DAB显色,苏木素复染,常规脱水、透明、封片。显微镜观察。
1.5 图像分析 对免疫组化切片进行分析:通过光学显微镜(200×)摄取图像,输入图像分析系统内,对图像进行灰度变换,使阳性面积与背景分开,进行自动测量。对每例切片随机选取15个不重叠视野,计算阳性面积和整个视野面积的比例的比值,取其平均值进行比较。
1.6 统计学方法 实验数据以均数±标准差( X ± S )表示,组间差异比较采用单因素方差分析,p<0.05为有统计学差异,由SPSS11.5统计软件分析完成。
2 结果
2.1 血糖和一般状况
糖尿病大鼠在实验期间表现出多饮、多尿、多食、毛色粗糙等症状,贝那普利治疗后血糖水平及体重无变化。
2.2 胰腺组织中血管紧张素Ⅱ含量与血液胰岛素的变化情况
与正常组相比糖尿病未干预组胰腺组织中的血管紧张素Ⅱ含量明显升高，用贝那普利干预8周后，其在胰腺组织中的含量下降，与正常组相比无统计学意义。糖尿病未干预组胰岛素分泌量减少，贝那普利干预后分泌量增加。
2. 3 各组大鼠TGF-β1 及Smad3 蛋白的在胰腺组织中的表达情况
通过分析表明胰腺组织中的TGF-β1及Smad3在糖尿病未干预组中明显增加，贝那普利干预后其表达量减少。免疫组织化学结果分析。
3 讨论
T2DM大鼠模型,胰腺的间质胶原表达水平升高,间质纤维化明显[ 1-3 ] 。胰腺纤维化可能会干扰胰岛β细胞之间的信息传递,从而降低胰岛素的分泌效率。现已明确局部RAS系统在调节器官局部的结构和功能中起着重要的作用,体内诸多器官如心脏、肾脏和肝脏等的纤维化都与局部RAS的激活相关[4、9、10]。目前认为局部AngⅡ能通过AT1受体上调转化生长因子-β1(transforming growthfactor-β1,TGF-β1)和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)等前硬化因子促进器官局部的纤维化形成。研究人员利用ACEI和ARBs类药物对RAS系统的药理作用，研究其对ZDF鼠胰腺形态、结构和功能的影响。结果发现：与正常组相比,未干预组ZDF鼠胰腺局部RAS表达增强，光镜下显示胰岛增大，胰岛细胞水肿，胰岛结构紊乱，边界不清，而且出现了严重的纤维化；免疫组织化学检测结果显示Ⅰ/Ⅳ型胶原和转化生长因子-β1(TGF-β1) 表达增强，而药物干预组胰岛结构有改善。Ⅰ/Ⅳ型胶原和TGF-β1表达降低[7],这说明ZDF大鼠胰岛内纤维化的部分原因与RAS激活和TGF-β1/Smad通路有关。Ko等[9]以另一种T2DM模型OLETF大鼠为研究对象,用雷米普利干预后发现胰腺纤维化减轻,同时糖耐量也得到改善,他们认为该结果与TGF-β1的表达降低有关。另外，Yamada 等[5]、Kuno等[6] Nagashio等[7]分别发现AT1R拮抗剂和ACEI类药物可改善胰腺炎动物模型胰腺的纤维化状况。进一步提示胰腺局部RAS可能在多种病理条件下参与了胰腺的纤维化，并且指出该效应是由AT1R介导，上调TGF-β1表达而实现的。其中过度激活的胰腺局部RAS是如何通过AT1R介导上调TGF-β1而引起胰腺纤维化增强的及其具体信号转导机制还有待于进一步研究[8]。本实验研究了贝那普利对Wistar糖尿病大鼠胰腺组织中TGF-β1和Smad3表达和RAS系统的影响,结果与以上所述的研究结果一致。
目前认为[12]胰腺纤维化主要是由于胰腺组织中以胶原为主的细胞外基质,合成与沉积增加、降解减少, 两者失去动态平衡所致, 最终将导致胰腺内、外分泌功能严重障碍。胰腺纤维化形成的分子机制尚未完全阐明, 多种细胞因子在胰腺纤维化发生发展中可能起重要作用[ 9-10]。但胰腺星形细胞(PSCs)可能是胰腺细胞外基质蛋白的主要来源。生理条件下PSCs处于静止状态,激活的PSCs可表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscleactin,α-SMA),而且可合成Ⅰ型、Ⅲ型胶原和纤连蛋白等细胞外基质成分。胰腺纤维化的部分原因可能与PSCs激活有关。此外,体外研究[5]表明,高血糖可上调PSCs AT1α受体表达,并可浓度依赖性地刺激PSCs的增殖,且其增殖率与AngⅡ水平呈正相关,但坎地沙坦和雷米普利可阻断该效应。以上实验均说明高血糖环境下PSCs的激活是RAS依赖性的,该结果和Reinehr等[11]研究结果一致。关于胰腺纤维化的分子生物学机制有待进一步的实验研究。
另外，我们的研究还发现贝那普利能改善血糖水平、缓解血胰岛素下降,国内外其他学者在类似的模型中也发现其他类的ACEI对血糖均有或多或少的改善作用,其机制可能与其能改善胰岛纤维化，抑制胰腺局部RAS系统激活有关。
本实验通过研究贝那普利对糖尿病大鼠胰腺组织中TGF-β1和Smad3表达和RAS系统的影响。表明胰腺局部RAS系统和TGF-β1/Smad通路在糖尿病时是激活的, 糖尿病未干预组血糖增加、胰岛素分泌减少、体重减轻。TGF-β1 及Smad3蛋白的表达明显增加。胰腺组织中的血管紧张素Ⅱ含量增加。贝那普利治疗后除体重及血糖无变化外上述指标均有改善。充分证明了贝那普利治疗可改善胰腺纤维化及胰岛功能的作用。
参考文献
[1] Tikellis C, Wookey PJ, Candido R, etal. Improved islet morphology after blockade of the reninangiotensin
system in the ZDF rat. Diabetes, 2004,53:989 - 997.
[2] Chu KY, Lau T, Carlsson PO, etal. Angiotensin II type 1 receptor
blockade improves beta-cell function and glucose tolerance in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetes,
2006,55:367-374.
[3] Ko SH, Kwon HS, Kim SR, etal. Ramipril treatment suppresses islet fibrosis in Otsuka Long-Evans Tokushima
fatty rats.Biochem Biophys Res Commun, 2004,316:114-122.
[4] 李晓永,苏青.胰岛内肾素-血管紧张素系统的研究进展.上海交通大学学报（医学版）,2008，28:901-904.
[5] Yamada T,Kuno A,Masuda K,etal.Candesartan,an angiotensin Ⅱ receptor antagonist, suppresses pancreatic
inflammation and fibrosis in rats.J Pharmacol Exp Ther,2003,307:17-23.
[6] Kuno A ,Yamada T,Masuda K,etal. Angiotensin converting enzyme in-hibitor attenuates pancreatic inflame
mation and fibrosis in male Wistar Bonn/Kobori rats. Gastroenterology,2003,124:1010-1019.
[7] Nagashio Y,Asaumi H ,Watanabe S,etal. Angiotensin Ⅱtype receptor interaction is an important regulator for
the development of pancreatic fibrosis in mice.Am JPhysiol Gastrointest Liver Phyiol,2004,287:G170-G177.
[8] 李才,张一宁, 牛俊奇, 候芳玉, 黄三英, 李广生, 孙立波, 张得恒. 器官纤维化基础与临床. 北京人民卫生出版
社,2003:268-284.
[9] Ko SH, Hong OK, Kim JW, etal. High glucose increases extracellular
matrix production in pancreatic stellate cells by activating the renninangiotensin
system. J cell Biochem, 2006,98:343-355.
[10] Lupi R,Del Guerra S,Bugliani M,etal.The direct effects of the angiotens inconverting enzyme inhibitors,
zofenoprilat and enalaprilat, on isolated human pancreatic islets.Eur J Endocrinol,2006,154:355-361.
[11] Reinehr R, Zoller S, Klonowski Stumpe H, etal. Effects of angiotensin
II on rat pancreatic stellate cells.Pancreas,2004,28:129-137.
[12] 李新,袁莉.胰腺肾素-血管紧张素系统与胰岛功能. 国际内分泌代谢杂志. 2007，27：157-159.