关于内皮祖细胞慢性缺血心肌内移植效果的研究

近年来，冠状动脉微循环在心血管疾病中的作用受到重视，血栓是导致冠状动脉微循环障碍的常见原因。目前推测其原因之一是心外膜冠状动脉(较大的血管)内不稳定的粥样斑块破溃、裂开及脱落，大量富含脂质的斑块碎屑、纤维蛋白以及聚集的血小板进入冠脉微循环形成微血栓栓塞[1-3]；原因之二是心肌深处(心内膜) 冠状动脉微血管内的原位血栓形成[4]。

　　反复大量的微血栓在造成心肌微血管床大量丢失的同时，微梗死的面积也在逐渐扩大，其造成的微血管阻塞及心肌小梗死灶，会导致心律失常、猝死、心肌纤维化、心衰等一系列严重后果，也是缺血性心肌病发病的机制之一。随着干细胞研究技术的发展，越来越多的学者关注于应用干细胞治疗缺血性心脏病，内皮祖细胞( endothelial p rogenior cells, EPCs)作为血管内皮的前体细胞参与包括血管内皮修复、缺血器官以及肿瘤组织的新血管形成等多种生物学活动，为促进血管新生提供了良好的细胞来源，是治疗缺血性心脏病的理想细胞来源[5-7]。

　　血管内皮生长因子(VEGF) VEGF 能增加小血管的通透性、促进内皮细胞增殖和迁移, 抑制内皮细胞凋亡, 并能刺激内皮细胞产生纤溶酶原激活物, 从而有力地促进血管新生[8-9]。

　　我们采用大鼠冠状动脉内注射月桂酸钠的方法制作冠脉微循环原位血栓模型。提取提取大鼠骨髓干细胞，经体外诱导、分化为培养内皮祖细胞（EPCs）并进行血管内皮生长因子(VEGF)基因修饰。通过冠状动脉途径将基因修饰后的内皮祖细胞回输入心肌内，通过组织病理学检测，心脏超声检测心肌缺血，Elisa 法检测外周血血管生成因子水平，研究内皮祖细胞缺血心肌内移植的血管生成作用，探讨此项细胞移植技术在慢性心肌缺血中的应用价值。

　　1 材料和方法：

　　1.1 动物

雄性SD 大鼠90 只体重 (250±30) g，购于哈尔滨医科大学附属第二临床医学院动物中心。实验动物及实验步均按照合国家实验动物管理条列执行。

　　1.2 试剂与器材

月桂酸钠 (Sigma，L9755 )，VEGF ELISA 试剂盒(美国 R&D)，中性甲醛固定液(南京化学试剂公司生产)，VIII 因子（北京博奥森生物技术有限公司），戊二醛（湖北新景新材料有限公司） Motec Digital Microscope 成像分析系统 (德国 Motec )，透射电子显微镜(日本JEOL )，超声仪 (GE Vivid7 )，L550 离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)。

　　1.3 实验分组

大鼠冠脉微循环原位血栓模型的建立成功后，随机将实验动物分为以下4 组内皮祖细胞组（EPCs 组），在模型建立后，用微量注射器在左心室处随机选择5 点进行内皮祖细胞组回输（n＝30）；转染VEGF 的内皮祖细胞组（EPCs+VEGF 组），在模型建立后，用微量注射器在左心室处随机选择5 点进行转染VEGF 的内皮祖细胞回输（n＝30）；假手术组(Sham)，在模型建立后，用微量注射器在左心室处随机选择4 点给予生理盐水注射（n＝30）；对照组（negetive control，Ncon），正常大鼠（n＝24）。

　　1.4 实验方法

1.4.1 大鼠冠脉微循环原位血栓模型的建立及鉴定

Wistar 大鼠，250±30g，10%水合氯醛（0.35ml/100g）腹腔内注射麻醉；气管插管连接呼吸机，左前外侧第三肋间切口进胸，剥离心包膜，分离主动脉并用血管夹夹闭主动脉后，迅速以微量注射器从主动脉注射月桂酸钠(1μg/g)，夹闭20s。松开血管夹，待呼吸心跳稳定后逐层关胸，拔除气管插管，术毕腹腔注射80 万单位青霉素，普通饲养。

　　1.4.2 内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

1.4.2.1 内皮祖细胞的分离、培养

100±20gWistar 大鼠，水合氯醛（0.35ml/100g）腹腔内注射麻醉；依次开皮，分离肌肉，血管，取出双侧胫骨和股骨；于无菌条件下将附着于骨骼上的残余组织剥净，并用PBS 进行冲洗，用剪子从中段剪短长骨，以M199 培养液冲洗骨髓腔，200 目孔不锈钢筛网过滤骨髓冲洗液，采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞。将分离的骨髓单个核细胞按4×105/cm2接种于包被好Fn 的培养瓶中，每瓶中加入M-199 完全培养液3ml，含5%胎牛血清、VEGF10ng/ml，bFGF 2ng/ml，IGF-1 2ng/ml。置于5%CO2 孵箱中，37℃培养，4 天后换液，以后每2 天换液一次。细胞活性检测：取一滴细胞悬液与一滴 0.2％台盼兰染液混合，死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。3min 内计数 200 个单核细胞，计算活细胞的百分率（活细胞数/总细胞数×100%）。

　　1.4.2.2 内皮祖细胞的鉴定

使用倒置显微镜观察细胞形态及生长情况，流式细胞仪检测培养7 天后CD133+、VEGFR-2+细胞数；DiI-ac-LDL 和FITC-UEA-1 凝集素双染鉴定；Matrigel 管状结构形成试验，观察其分化情况

1.4.3 重组腺病毒载体Ad-GFP-VEGF 内皮祖细胞转染及功能鉴定

1.4.3.1 内皮祖细胞转染:

　　取出于对数生长期的EPCs，0.25%胰酶消化后，移入50 mL 离心管中，1 000 rpm 离心10 min。弃去上清后，加入1ml M199 培养基重新混悬细胞，取10μl 细胞悬液在倒置显微镜下计数。按每孔1×105 个细胞加入6 孔板中，10%血清，M199 培养24 小时以使细胞贴壁。

　　将病毒溶液稀释为107/100μl，按照MOI＝50 进行内皮祖细胞转染。组A：重组腺病毒载体转染组，每孔加入50μl 的Ad-GFP-VEGF；组B：空载体转染组，在孔内加入50μl 的Ad-GFP(本实验室自备)；组C：空白对照组，在孔内加入50μl 的M199 培养液。将以上各组细胞轻轻摇动混匀，于37℃，5% CO2 条件下培养12 h。弃去原培养液，加入2mL 新鲜培养液，于37℃，5% CO2 条件下继续培养以备功能检测和细胞回输。

　　1.4.3.2 功能检测:

　　(1)EPCs 转染24 h 后，于倒置荧光显微镜下观察转染效果。(2)用0.25%胰蛋白酶消化后，各组细胞悬浮在500μl 培养液并计数，调整细胞密度，按照5×104/孔将细胞悬液平铺在24孔板上，37℃ 5%CO2 孵箱培养2h。弃掉原培养液，除去未贴壁细胞，每组随机选择10 个视野，计数贴壁细胞(×200)。(3)将待检细胞弃去原培养液，改为无血清M199 培养液于37℃，5%CO2 孵箱培养12h。将预处理的细胞消化离心，并用新鲜M199 培养基进行重悬，调整细胞浓度为1×105。将100μl 细胞悬液注入Transwell 小室的上室并在下室加入200μlM199 培养液和VEGF 10μl ( 50 ng/ml)，在37℃ 5% CO2 孵箱培养12 h，取出微孔滤膜，PBS 漂洗，以无水乙醇固定，苏木精染色,，37℃烤膜过夜，无水乙醇脱水，二甲苯透明滤膜，随机选择10 个显微镜视野(×400)计数迁移到低层的细胞。(4)MTT 法检测EPCs 增殖活性

1.5 检测指标

1.5.1 心脏功能检测：

　　分别于术后第1、7、28 天用超声检测各组对大鼠心脏功能改变。各组大鼠10%水合氯醛常规麻醉，胸前备皮，仰卧位固定，采用GE Vivid 7 彩色多普勒超声诊断仪，于左胸骨旁取左心长轴观和左室乳头肌短轴观。连续记录3 个心动周期的二维图像并贮存，供脱机后图像分析。于左室乳头肌短轴观测量左室收缩末期内径(LVDs)和左室舒张末期内径（LVDd)，计算缩短率(FS)和左室射血分数(LVEF)。每一指标测量3 个心动周期，取平均值。

　　1.5.2 荧光显微镜检测：

　　内皮祖细胞移植 4 周，开胸取出的心肌组织，迅速置于液氮保存，制备冰冻切片（厚8μm），10%甲醛固定后，在荧光显微镜下观察移植细胞的存活情况。

　　1.5.3 病理组织学检测：　内皮祖细胞移植后7 天，用水合氯醛处死大鼠。开胸，取出心脏，修剪去除心耳及主要大血管，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋。取左室乳头肌段心肌，连续切片，将组织切成4μm厚的切片，行HE 染色和马休黄－酸性品红－苯胺蓝（改良Lendrum 法）染色，观察冠脉微血管原位栓塞形成及纤维化程度。改良Lendrum 法染色，纤维素呈鲜红色，肌纤维呈红色，细胞核呈蓝褐色，胶原纤维呈蓝色，红细胞呈黄色，陈旧的纤维素成紫蓝色

1.5.4 VIII 因子免疫组化检测：

　　将内皮祖细胞移植4 周后，开胸取出的心肌组织，经聚甲醛固定，石蜡包埋，切成5μm厚的切片，依次经脱蜡、抗原修复、一抗和二抗孵育、显色、复染、脱水、松油封片等步骤。

　　各组随机选择3 张切片，于倒置显微镜下观察，每张切片随机选取10 个视野，计算Ⅷ因子阳性的毛细血管，以平均值作为新生血管数。

　　1.5.5 ELISA 检测VEGF：

　　各组动物均于细胞移植后1、7、28 天取血（n＝6/组/时间点），3000rpm 离心10min，ELISA 试剂盒检测血清中VEGF 的浓度。

　　1.6 统计学处理

实验数据采用Mean±SD 表示，多组间比较采用方差分析（ANOVA），组内比较采用t检验，以P < 0. 05 为有显着性差异。

　　2 实验结果

2.1 内皮祖细胞组培养及鉴定

2.1.1 细胞形态学变化

在倒置显微镜下可见经诱导培养24 h 后的部分细胞开始贴壁、变大。第7 天左右，出现EPCs 典型形态特征 “集落”样结构和内皮细胞特征性形态——铺路石样结构(。集落中央为圆形细胞群，周边有梭形细胞不断生成，与原始血岛相似。

　　2.1.2 流式细胞仪鉴定结果

流式细胞仪检测结果显示VEGFR-2+、CD133+的细胞分别为79.44%和98.55％；VEGFR-2+、CD133+双标结果显示，两者均为阳性细胞百分率为78.88％

2.1.3 荧光双染结果

细胞被诱导培养7 d 后，荧光显微镜下可见能摄取Dil-ac-LDL 发红光的细胞(图-3A)，和能特异性结合FTIC-UEA-1 发绿光的细胞(图-3B)，以及既能摄取Dil-ac-LDL 又能结合UEA-1 的棕黄色双荧光细胞(图-3C)，该细胞为正在分化的EPCs。

　　2.1.4 Matrigel 管状结构

培养第 10 天，于倒置显微镜下可见，长宽比大于10:1 的类血管样结构，显示所培养的细胞具有成血管功能

2.2 重组腺病毒载体Ad-GFP-VEGF 转染对内皮祖细胞功能的影响

2.2.1 荧光显微镜下观察转染效果

通过免疫荧光技术分析转染效果。在荧光显微镜的激发下，组A (Ad-GFP-VEGF 转染,)和组B(Ad-GFP 转染,)可见细胞胞浆内有绿色荧光，而组C(空白对照组,)未见有绿色荧光，说明转染成功。

　　2.2.2 内皮祖细胞黏附功能鉴定

倒置显微镜(×200)下观察，进行细胞记数。各组贴壁内皮祖细胞数分别为组A vs 组B vs组C (57.70±8.55 vs 51.80 士4.18 vs 51.10 士5.30)，组A(Ad-GFP-VEGF 转染)与组B(Ad-GFP转染)和组C(空白对照组)比较，差异有显着意义(P<0.05)，组B 与组C 比较无统计学差异(P=0.805)。由以上结果可见向内皮祖细胞内转染VEGF 可明显增强内皮祖细胞的粘附能力，而单纯转染Ad-GFP 则对细胞的粘附功能改变不显着

2.2.3 内皮祖细胞迁移功能鉴定

倒置显微镜(×400)下观察，对Transwell 小室底面进行细胞记数。各组细胞数分别为组Avs 组B vs 组C (22.25±4.27 vs 18.38 士3.66 vs 18.00 士3.02)，组A(Ad-GFP-VEGF 转染)与组B(Ad-GFP 转染)和组C(空白对照组)比较，差异有显着意义(P<0.05)，组B 与组C 比较无统计学差异(P=0.841)。由以上结果可见经VEGF 基因修饰的内皮祖细胞其迁移能力显着增强，单纯转染Ad-GFP 对细胞迁移能力影响不明显

2.2.4 转染后EPCs 增殖活性

各组细胞经转染后，在酶标仪上于490nm 波长的吸光度分别为组A vs 组B vs 组C(0.34±0.07 vs 0.27±0.05 vs 0.23±0.04)，组A(Ad-GFP-VEGF 转染)与组B(Ad-GFP 转染)和组C(空白对照组)比较差异有显着意义(P<0.05)，组B 与组C 比较无统计学差异(P=0.174)。两组间的比较差异有显着性(P<0.05)。可见，经VEGF 转染后，内皮祖细胞的增殖活性得到了增强，而单纯转染Ad-GFP 对内皮祖细胞增殖活性与对照组相比无显着改变

2.3 VEGF 基因重组内皮祖细胞回输模型后功能检测

2.3.1心脏功能检测：

　　术后第1、7、28 天各组超声检测结果如表-1 所示，① control 组不同指标在各时间点比较无明显差异；② EPCs 、EPCs+VEGF、Sham 组与control 组比较，术后心功能均有不同程度的降低，并且随着时间的推移，有逐渐下降的趋势，特别是Sham 组心功能下降尤为明显；③ EPCs 、EPCs+VEGF 与Sham 组比较，术后1 天差异不明显，术后第7 天、术后28 天差异有统计学意义；④ EPCs 组与EPCs+VEGF比较，术后第1 天、术后7 天差异变化不明显，术后28 天比较差异有统计学意义。

　　2.3.2 荧光显微镜检测：

　　术后28 天，Control 组几乎未见到GFP 标记的移植细胞，而EPCs+GFP-VEGF 组则可见较多的移植细胞，移植细胞多分布于血管壁，有少数分布于心肌细胞间隙。

　　2.3.3 病理组织学检测：

　　HE 染色观察术后7 天心肌组织病理学改变（图-10）。Sham 组心肌微血管内弥漫分布着由血细胞、血小板和纤维蛋白构成血栓混合物，炎症细胞浸润明显，并可见局部心肌凋亡坏死。Control 组心肌细胞排列整齐， EPCs+VEGF 组及EPCs 组心肌组织病理变化均与Sham组相似，但较之明显改善；马休黄－酸性品红－苯胺蓝染色（图-11），Control 组未见明显的血栓形成， Sham 组可见多量由纤维素构成的原位栓塞，EPCs 组和EPCs+VEGF 组亦可见少量的原位血栓。

　　2.3.4 VIII 因子免疫组化检测：

　　术后 28 日，各组Ⅷ因子阳性的毛细血管计数示（图-12）① EPCs 组（10.27±3.05）和EPCs＋VEGF（12.17±3.16）组微血管数目与对照组（8.17±2.65）比较差异有统计学意义（p＝0.040、p＝0.000），与Sham 组（8.60±2.22）比较差异有统计学意义（p＝0.023、p＝0.000）；② EPC 组与EPCs＋VEGF 组比较差异有统计学意义（p＝0.010）；③ Sham 组与Control 比较差异无统计学意义（p＝0.550）。

　　2.3.5 ELISA 检测VEGF：　各组动物细胞移植后1、7、28 天血清中VEGF 含量如表-2 示：① EPCs＋VEGF 组在各时间点较之于其他各组，血清中VEGF 浓度明显上升，差异有统计学意义（P<0.000）；② EPCs组血清VEGF 浓度略大于Sham 组，但差异无统计学意义；③ EPCs 组与Control 组较差异有统计学差异（P<0.05）；④ Sham 与Control 比较，差异无统计学差异，各处理组在各个时间点，血清VEGF 浓度的变化趋势如

3 讨论

缺血性心脏病是导致人类死亡的最常见病种之，特别是在北方地区，由于地理位置和生活习惯等原因使得这一类疾病有逐年增高的趋势，严重威胁了人们的身体健康，影响生活和工作。每年用于此类疾病的医疗费用数以亿计，严重制约了社会经济的发展。寻求有效、可靠、安全的治疗手段一直是医务人员不懈努力的追求，也是社会经济发展客观、必要的要求。

　　循环中 EPCs 的量及其功能异常与缺血性心脏病有重要的关系。最近的研究显示冠心病病人循环中的EPCs 数量下降了近50%，定向移动能力受损。还有研究证明高龄、糖尿病、高脂血症及同源半肤氨酸血症等均能削弱EPCS 的功能，包括EPCs 的动员和整合到新生血管中的能力[10]。因此促进EPcS 从骨髓中动员将有可能降低冠心病发病的危险因素、补充血管受损部位的EPCs 及加速血管修复。对于不适用传统血管再通治疗的弥漫性冠脉疾病患者 ,内皮细胞是一种较具应用前景的治疗方法。该方法能够增加缺血组织侧枝循环的形成 ,缓解临床症状的同时 ,改善心肌血供。

　　VEGF 是目前己发现的众多血管生成正性调节因子中促血管生成效应最强的内皮细胞生长因子，它不仅是血管形成和血管新生所必须的调节因子，还是EPCs 的外源性动员剂，对出生后的血管形成起主要的调节作用。Asahra[11]等观察到由VEGF 诱导的从骨髓动员出来的EPCs 能在体外增殖并在体内促进血管新生。粒系巨噬系集落刺激因子(GM-CSF)是作用比较强大的骨髓动员剂，它能有效地动员骨髓中粒系、巨核系和红系的前体细胞进入循环，研究发现它也是EPcS 的外源性动员剂之一。Takahashi 等[12]利用后肢缺血的动物模型证明预处理的GM-SCF 能非常明显增加循环EPCS 的数量并促进它们的分化。Gehling 等[13]发现培养Ac133 十细胞时加入VEGF 能分化成造血细胞系和内皮细胞系。上述动物体内移植和体外培养研究的结果表明以这些动员剂为基础有望研制开发一些具有临床应用价值的促血管生成药物。但是直接输入VEGF 有一些常见的副作用 ,如 VEGF 诱导NO 释放 ,引起短暂性低血压;VEGF 增加血管通透性 ,导致周围性水肿;VEGF 不仅在正常机体的生理性血管生成过程中起作用 ,还对肿瘤、各种炎症、缺血性疾病及增殖性视网膜病变等病理过程起调节作用 ,VEGF 的应用可能会促进病理性血管生成 ,引发或加速病变发展同直接补充 EPCs 的外源性动员剂相比，基因转染不仅能避免全身副作用，而且裸质粒DNA 和腺病毒载体具有一次转染即能阶段性地持续释放促血管因子的特性。转染VEGF 的EPCs 除能促进血管新生外，还能动员骨髓EPCs 定向移动到缺血部位增强血管发生。Iwagur。

　　等10 将携带有VEGF 基因的腺病毒转染入EPCs 中，再将基因转染的EPCS 移植到后肢缺血的动物模型中去。移植后缺血后肢的血管新生和血流量的恢复都提高了，与对照组相比，肢体的坏死率和自主截断率减少了63.7%。转基因EPCs 的建立能从本质上对糖尿病等引起的EPCs 功能减低进行治疗，并且为EPCs 移植时从外周血分离和扩增的EPCs 数量有限提供新的解决办法。

　　从各组超声检测指标变化趋势所示可见，心脏微栓塞后随着心肌纤维化程度的增加，心功能受损成递进的过程，心功能逐渐降低，在这一过程中，进行VEGF 重组EPCs 回输，可以有效减慢心功能受损，尽管单纯回输EPCs 也可以在一定程度上延缓这一过程，但就程度而言，稍逊于EPCs+VEGF 组，原因可能是VEGF 增加了EPCs 与心肌微血管之间粘附，使得有更多的EPC 得以参与血管新生和血管生成，因而减缓了心功能受损的程度。

　　近年来，利用EPCS 进行细胞移植和基因治疗，增强缺血性疾病的侧支血管生长和血管再生。骨髓与外周血取材简便，不影响人体健康;EPCs 的体外分离和培养扩增也相对容易，成为自体移植的理想选择。由于血管EPCS 具有定向迁移的特性，不仅可直接应用于血管发育异常性疾病的治疗，而且也可作为促血管生长因子的载体，通过体外转基因技术，用于活体基因治疗，进一步扩大治疗范围和效果，具有广阔的应用前景。